1. deprehendere absorbance RNA solution
Absorbance in 280, 320, 230 et 260 um valores acidi nucleici, background (solution turbiditatis), concentratio salis, et materia organica ut interdum, respective.Fere solum ad OD260/OD280 (Ratio, R).Cum 1.8~2.0, putamus contaminationem interdum vel alia materia organica in RNA tolerari posse, at notandum est, cum Tris usus est ut quiddam ad absorbancem deprehendendum, R valor maior quam 2 esse potest (plerumque <2.2).Cum R<1.8, pollutio interdum vel alia materia organica in solutione manifestior est, et sors RNA secundum necessitates determinari potest.Cum R>2.2, significat RNA hydrolyzatum in acido uno nucleico.
2.Electrophoretic exemplar RNA
Fere, gel denaturing pro RNA electrophoresis adhibetur, sed si solum ad detectam qualitatem RNA, denaturing gel non est necessaria, et vulgare agarose gel adhiberi potest.Propositum electronicae est ut vincula 28S et 18S integritatem earumque proportionem deprehendas, vel variantis variantis linis.Fere si 28S et 18S vincula sint clara, clara, et acuta (referendo ad margines vincula clara sunt), et splendor 28S est plus quam bis 18S cohortis, consideramus qualitatem rna esse bonam.
Praedicti duo methodi, quibus vulgo utimur, neutrum horum duorum modorum clare indicare nobis potest num in solutione RNA residua RNase sit.Si in solutione RNase perexigua quantitas est, difficile est nobis eam methodo praedicta detegere, sed pleraeque enzymaticae subsequentes reactiones supra 37 gradus et diu peractae sunt.Hoc modo, si in solutione RNA RNase perexigua copia sit, valde opportunum erit ambitus ac tempus suas partes agere in experimentis subsequentibus, et experimentum hoc tempore friget utique.Infra methodum introducimus quae confirmare potest num residua sit RNase in solutione RNA.
3. Caloris conservatio test
Iuxta intentionem specimen, duo 1000 NG RNA e solutione RNA trahunt et ad tubo centrifugii 0,5 ml adde, et cum pH 7.0 Tris quiddam totali volumini 10 ul adnectere, et deinde pileum tubi signare.Unum ex eis in aqua temperatura assidua balnei 70°C pone et calefieri per 1 h.Altera pars in -20°C armario reposita est pro 1 h.Cum tempus expletum est, duo exempla pro electrophoresis remove.Post electrophoresis peracta, vincula electrophoretica utriusque compara.Si vincula duorum constantes sunt vel nullam differentiam significantem (scilicet vincula eorum etiam condiciones in methodo occurrent 2), significat quod nulla residua RNase contaminatio in RNA solutione et qualitas RNA valde bona est.Contra, si specimen incubatum 70°C manifestam degradationem ostendit, RNase contaminationem in RNA solutione indicat.
2 Experimentales methodi et artes extractionis RNA
Problemata saepe occurrentia cum RNA extrahendo sunt: (1) RNA cedit humilis;(2) rna sal pollutio gravis est;(3) RNA gravem organicam contaminationem solvendo habet;(IV) degradatio et alia problemata
1. Communiter summa RNA extractionem reagentia
Guanidinum methodus isothiocyanatis et methodus trizol usi communissime methodi ad extrahendam RNA e textuum animalium et cellulis animalis.Praecipue convenit parvis exemplis et texturis, quae maxime difficilis sunt ad extrahendum, sicut ex toto RNA e cute leporis et texti animalis nota extractio;praeterea Trizol, lysis generalis propositum-reagens, adhiberi potest etiam ad extrahendas fibras plantae, bacteria, fungos et alia fibras.Ad fibras plantarum quae polysaccharides et polyphenola continentur, ut camellia oleifera, folia tea, rapeseed, etc., methodus CTAB etiam ad summam RNA extrahere potest.
Pro ratione conventionali, methodus bipartita valde vulgaris est propter debitam temperaturam operationis normalem, nihil opus est RNase addere, et salutem — non chloroformes, phenolas et alia organica reagentia ad extrahendum.(commendatae products )
2. Extractionem totalis RNA e fibris animalis
(1) Conare eligere recens textus, si recens non est (potissimum intra tres menses - 80 refrigeratum vel in liquido nitrogenium congelatum. Cum textura secans, ne directe in locus temperatura secet, cave in cista glaciei impone, iteratum congelatio et tabida vitare conetur.
(2) Utere forcipe puro et forcipe particulam textili secare, mediam partem textus secare conare, cum specimen secans, vel primum e medio incisurae magnae partis texti, et deinde incisurae loco recenti specimen incisum.TEXTUS remotus plene alumen debet, alumen in fistulam EP sine RNase pone, lysatam adde, aluminis lysati plene exponatur et homogenizationem praeparet.
(3) Pro normalibus fibris, selectis fibris mung fabae mediocri (30-60 mg) ad homogenizationem.Si fibrae insunt magnam quantitatem interdum, pinguium, vel fibrarum fibrarum densarum ut hepatis, convenienter augere vel diminuere quantitatem fibrarum incisarum (libitum) Elige 10~20 mg).
(4) Si pisces musculi, squillae carnes, jellyfish et alia tela cum aqua alta contenta extrahantur, volumen specimen recte augeri debet (commendatur 100-200 mg).
(5) Si condiciones permittunt, textus animalis protinus extrahi potest, postquam homogenized cum texturae altae homogenizeris, si talis instrumenti non est.
(6) RNA consecutus post extractionem finalem in capsam glaciei positam statim ad degradationem RNA minuendam.
3. Animal cell RNA extractionem
(1) Suspensionis cellulae: centrifugium directe et medium abiicias, lava cum sterili PBS per 1-2 tempora, tum suspende cum debito PBS quantitatem, et postea lysatem ad lysin adde.Lysatam noli directe ad cellulas praecipitatas post liquidum penitus abiecta.Hoc sarcinam histonicam emissam faciet post cellulas lysedorum in strato exteriore ad adhaerendum cellulis praecipitatis extrinsecus, inde contactum cellularum intra globulo cum lysate terminans., unde in cellula imperfecta Lysis et RNA cedit.
(2) Cellulae quae sunt semi-adhaerentes vel non arcte adhaerentes: Post medium abiecta, cum PBS per 1-2 tempora ablue, protinus debitum PBS quantitatem hauriunt et culturam patellae cum fistula vel sclopeto ad cellulas sufflandas transmittunt, easque ad cellulas RNA-liberas transferunt.Lysatum ad EP fistulam enzyme extrahendam adde.
(3) Cellulae adhaerentes: primum trypsin concoquendum, deinde in RNase liberum EP fistulas colligendum, centrifugium ad supernatantem 1-2 lotum cum PBS ad removendum trypsin excessum, et resuspendendum cum congrua quantitate PBS Deinde ad gradum extrahendum procede.
4. Plant RNA extractionis
Fibrae plantae in compositionibus phenolicis abundant, vel polysaccharidibus pollent, vel aliquas metabolitas secundarias inidentificatas continent, vel altam actionem RNase habent.Substantiae hae arcte cum RNA post lysin cellae coniunctae sunt ad complexiones insolubiles vel praecipitationes colloidales formandas, quae removendae sunt difficiles.Ergo, cum extrahuntur plantae textus, ornamentum plantarum eligere oportet.Lysatus in ornamento quaestiones faciles oxidationis polyphenolorum solvere et separationem compositorum polysaccharidis et acida nucleici potest.
(Pro polysaccharide polyphenolum planta RNA extractio, producta commendata:
(1) Cortices, pulpa, semina, folia, et cetera plantae in mortario plene trita.Per processum molere, liquor nitrogenium repleri debet in tempore ad vitandam liquefactionem exempli.Humus exempli causa cito additur lysato et conquassato ad vitandam RNA degradationem.
(2) Ad exempla fibra divitum, ut oryzae et triticum folia, summa extractionis convenienter minui debet, alioquin textura stridor et lysis non erit plena, unde in RNA demissa poma extracta sunt.
(3) Ad fibras plantarum cum aqua contenta alta, ut fructus mali punici, fructus PEPO, fructus persici, etc., magnitudine exempli bene augeri debet (100-200 mg libitum est).
(4) Fibrae plantae, ut plantae folia, rhizomata, fructus duriores, aliaeque materiae plerumque commendantur, uti liquido NITROGENIO ad in mortario medicamenta penitus inepto, ac deinde ad extrahendam gradum.TEXTUS CONVENTALIS homogenizorum efficax non potest in fibris plantarum homogenizing ac plerumque non commendatur.
5. Cautiones ad RNA extractionem
(1) Specimina TEXTUS quam recentissima esse debent quam iterata congelatio et tabida vitanda.
(2) TEXTUS plene in extrahendo esse debet, et copia textus non parum, nedum nimium sit.
(3) Sufficiens incubationis tempus dandum est addito lysato ad lysinam exempli causa.
(4) Cum Trizol methodo extrahendi utens, principium absorbendi supernatantem post stratificationem "mavult plus attrahere quam attrahere", et ad medium stratum extrahi non debet, alioquin gravem contagium genomicum DNA causabit.
(5) Cum lavatio, liquor lavacrum circa tubulum parietem plene inlinquere debet, ut penitus abluatur.
(6) Ad extrahendi modum columnae, praeter dimissionem columnae loto, adsorptionem columnae etiam in scamno ultra-mundo collocari et 5-10 minutatim sufflare, ut organicum siccitati solvendo plene evaporat.
(7) Ad ultimam elucidationis columnae methodum, addito DEPC aqua, incubari debet per 3-5 minutas, vel aqua DEPC calefieri ad 60°C in antecessum ad augendam elutionem cedat.In tradito Trizol Fissio et methodo praecipitationis isopropanol, ultima RNA in aqua DEPC dissolvitur, ut opportunum tempus solutioni daretur, et fundum centrifugii tubus continuum cum fistulae apice flare debet.
3 Three Causae et solutiones pro low RNA concentration / qualis pauper
1. Proventus est preme
Specimen extractum est nimis humile, summa copia insufficiens est;textus vel cellulae qualitatis aptae ad extrahendam adhibeantur, prae- curatio exempli facienda bene et lysis sufficiat.
2. Genome residua
Cum Trizol methodo extrahendi, cum supernatans in medium stratum post iactum exsorbetur, gravis contagium genome causabitur;extra curandum est, cum in medio tabulato iacuit, ne sugere possit.Si modus columnae extrahendi adhibetur, ornamentum in quo DNase sum extrahendi seligi potest.Acidum nucleicum membranae adsortatum in directum cum DNase I concoquitur, quod residua DNA multum minuere potest.
3. RNA degradatio
Potest degradatio ipsius exempli extrahendi, vel degradatio facta in processu extrahendo;recentia exempla pro RNA extractione adhibeantur, et exempla collecta in nitrogen vel -80°C refrigerato liquore tempore recondantur, et vitanda sint iterata congelatio et tabida.RNase/DNase liberorum apicibus, tubi centrifugii et aliarum materiarum in RNA processu extractionis adhibenda sunt.Processus extractio debet esse quam citissime.Extractum RNA in capsa glaciei imponenda et tempore -80 reposita.Si RNA extractum necesse est ut per gel electrophoresin deprehendatur, electronica statim ab extrahendo facienda est, et electronico- phorisis cum novo praeparato reponi debet.
4. Sal et organica residua solvendo
Extractio reagentia continet phenolum et guanidinem sales, et lavatio continet solutionem ethanolum.In processu extrahendo, lysata non totaliter absorpta et abiecta est, et lavatio non plene exsiccata fuit.Salis residua et organica solventes laedunt subsequenti transpositione transversali et PCR.Diversi gradus inhibitionis, ut textus lysatus in processu extrahendo plene removeatur, et lavatio sufficiat, ut circa parietes tubi lavari possit.Praeterea, tubus emissus et sufflatus est gradus necessarius, qui residuum materiae organicae ulterius reducet.
Ad plura de RNA extractionis notitia, nostrum locum sequi placet:
www.foreivd.com pro magis notitia.
Post tempus: Dec-01-2022
