Materia incipiens: RNA
Transcriptio quantitatis PCR (RT-qPCR) experimentalis est methodus experimentalis adhibita in PCR experimentis utens RNA sicut materia incipiens.Hoc modo, tota RNA seu nuntius RNA (mRNA) primum in DNA complementario (cDNA) transcribit, transpositis transpositis.Postmodum, reactionem qPCR fiebat utens cDNA in exemplum.RT-qPCR adhibitum est in variis applicationibus biologiae hypotheticae, in analysi expressionis gene, RNA sanatio interventus, sanatio microarray, deprehensio pathogeni, probatio genetica, et investigatio morbus.
Unus gradus et duo modi gradus ad RT-qPCR
RT-qPCR perfici potest per unum gradum vel duos gradus modum.Unus gradus RT-qPCR componit transpositionem contrariam et PCR amplificationem, permittens transpositionem transmissam et DNA polymerasium ad perficiendam reactionem in eodem tubo sub iisdem conditionibus quiddam.Unus gradus RT-qPCR tantum requirit usum primariorum sequentiarum specialium.In duobus gradibus RT-qPCR, transpositio et PCR amplificatio in duobus tubulis aguntur, diversis opificiis optimizedis, condiciones reactionis, et primario consilio strategies.
Commodum | incommodum | |
Unus gradus | Haec methodus minus habet experimentalem errorem cum utraque reactiones in uno tube fiunt
Pauciores pipetting gradus reducere periculum contagionis
Apta summus throughput amplificationis / protegendi, celeriter et producibilis | Duo-gradus motus non optimized separatim
Cum condiciones reactionis coniungendo gradatim reactionem implicantur, sensus non tam bonus est quam modus viae gradatim.
Numerus scutorum deprehensi uno specimen est parvum |
Duo gradus | Facultas stabilium creandi bibliothecas cDNA, quae per longas temporis spatia condi potest et in multiplicibus reactionibus adhibita
Scopi genes et genesis ampliari possunt ex eadem bibliotheca cDNA sine necessitate plurium bibliothecarum cDNA
Reactio buffers et condiciones reactionem quae optimization enable unius reactionis currit
Lorem felis elit | Multiplices fistulae utentes et fistulae plures gradus contagionis DNA periculum augent; et tempus consumens.
Plus requirit optimization quam unus gradus modus |
Related Products:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (unus gradus) -SYBR Green I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (unus gradus) -Taqman
RT EasyᵀᴹI Master Premix For First-Stand CDNA Synthesis
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Electio totalis RNA et variante
Cum experimentum RT-qPCR designans, interest diiudicare utrum tota RNA vel mRNA purificata utatur exempli causa transpositionis transpositionis.Etsi variant sensus paulo altius providere possint, tota RNA adhuc frequenter adhibetur.Causa huius est, quia tota RNA maiorem utilitatem habet ut principium materiae quam variant.Primum, processus pauciores purificationis gradus requirit, qui meliorem quantitatem receptam templates et meliorem ordinationem effectuum ad cellulas numeros incipiens.Secundo, vitat mRNA locupletationis gradum, qui possit vitare facultatem alid consequitur propter diversas recuperationes diversarum mRNAs.Super, cum in plerisque applicationibus maior quantitas relativa scopo gene potior sit quam absoluta sensibilitas deprehensionis, tota RNA in pluribus aptior est.
Reverse transcription de primario
In gradatim methodo tres diversi modi adhiberi possunt ad primam reactionem cDNA: oligo(dT) primariis, incertis primariis, seu primariis specialibus seriebus.Typice, oligo (dT) primers et temere primers in compositione adhibentur.Hi primers anneal to the template mRNA strand and provide reverses transcriptase with a beginning point for synthesis.
Prima lectio | Structura et munus | Commodum | incommodum |
oligo(dT) primario (oligo dT) primario | Furnum extensum ad thymina residua poly(A) cauda variante;ancora oligo(dT) primarium continet G, C vel A in 3′ fine (ancoris situm) | Synthesis plenae longitudinis cDNA a poly(A)-tailed variant
Locum, ubi minus materia est available incipiens
Ancorationis situs efficit ut primario oligo(dT) ad 5′ poly(A) caudam mRNA ligat. | gena amplianda tantum apta cum poly(A) caudis
Da cDNA mutilum a situ priming* 2 in poly(A) ;
Obnixi ligare ad III "finem*
* Hanc facultatem minimized si oligo ancoris constiterunt (dT) primers sunt |
random primario
| 6 ad 9 bases longitudinis, quae pluribus locis in RNA transcription iungi possunt | Anneal omnibus RNAs (tRNA, rRNA, mRNA)
Apta ad transcriptos cum structurae secundario significante, vel cum materia minus incipiens praesto est
Princeps cDNA Cedite | cDNA est e diverso transscriptum ab omni RNA, quod plerumque non desideratum et signum scopo mRNA diluit.
cDNA adepto truncata |
ordo specialium primers | Custom primers targeting specifica mRNA sequences | specifica bibliotheca cDNA
Improve sensus
QPCR primers uti vicissim | Solum ad summam synthesim unius scopo gene |
Reverse transcriptase
Reverse transcriptase est enzyme quo RNA ad synthesim DNA utitur.Quaedam e transpositione transcriptases habent RNase activitatem et RNA fila in RNA-DNA, fila hybrida post transcriptionem degradare possunt.Si RNase enzymaticam actionem non habet, RNaseH addi potest ad efficientiam altiorem qPCR.Communiter enzymes includunt: virus econtra moloney murinum leukemia transcriptase et virus myeloblastomum e contrario transcriptase.Pro RT-qPCR, optimum est eligere res adversas transcriptas cum superiori thermostabilitate, ut cDNA synthesis in superioribus temperaturis peragi possit, dum RNAs cum superiori structurae secundario transcribendo succedit, salva sua plena actione per reactionem, quae in superiori cDNA cedit.
Related Products:
Forasy M-MLV Reverse Transcriptase
RNase H actio e contrario transcriptase
RNaseH potest RNA fila depellere ab RNA-DNA duplexes, efficax synthesis subductis DNA duplicatis praebens.Nihilominus, cum longa mRNA in template, RNA praemature deponatur, cDNA proveniens.Ideo saepe utile est RNaseH activitatem in cDNA exquisitis obscurare, si synthesis longi transcriptionis desideratur.E contra, e contrario transcriptases cum RNase H actione saepe utiles sunt applicationibus qPCR, quia augent liquefactionem RNA-DNA duplexes in primo cyclo PCR.
Primarius design
PCR primariorum usus pro qPCR gradus in RT-qPCR optime designari debet ad coniunctionem exon-exon-exonis, ubi prima amplificatio potentialiter limitem exon-intronium actu educere potuit.Cum sequentia intron-continentia genomica DNA non ampliantur, hoc consilium periculum positivorum falsorum ampliatum minuit ab contaminatione genomica DNA.
Si primers designari non possunt ad fines exons vel exon-exon separatos, RNA exempla tractare cum RNase-libero DNase I vel dsDNase potest ut contaminationem genomicam DNA removeat.
RT-qPCR control
Reverse transcriptio negativa (-RT control) in omnibus experimentis RT-qPCR comprehendi debet ad contagionem DNA deprehendendam (qualia genomica DNA vel PCR producta e reactionibus praecedentibus).Haec moderatio continet omnes components reactionem nisi vicissim transcriptas.Cum transpositio transversa non occurrit cum hac potestate, si observatur amplificatio PER, contaminatio ex DNA verisimillimum est.
Post tempus: Aug-02-2022