• PCR methodus adhibetur ad amplificandum DNA ex parvo DNA template.RT-PCR transpositione transpositione utitur ad DNA templates producendum ex fonte RNA, qui tunc ampliari potest.
• PCR et RT-PCR typice reactiones designant, dum qPCR et RT-qPCR momenta ratiunculae producti synthesis in PCR ad quantitatem quantitatis Formulae praesentis adhibent.
• Recentiores methodi, sicut digitales PCR, absolutam quantitatem DNA templates initialis praebent, dum modi ut isothermal PCR necessitatem minuunt ad apparatum pretiosam ad certos eventus comparandos.

Catena polymerasis reactionis (PCR) est relativum simplex et late technica biologiae hypothetica adhibita ad DNA et RNA sequentia amplificanda et detecta.Comparati methodis traditis DNA exquisitis et amplificationis, quae saepe dies capere possunt, PCR paucas horas requirit.PCR permagnum est sensitivum ac minimam significationem ad detectionem et amplificationem certarum sequentiarum postulatarum.Basic PCR methodi progressus a simplicibus DNA et RNA deprehensio ulterius progressi sunt.Infra perspectum praebevimus de diversis PCR methodis et reagentibus quae apud Enzo Vitas Scientiarum investigationes providemus tuae necessitati.Ad scientias adiuvandas contendimus celeriter accessum per reagentes uti in proximo inceptio investigationis!

PCR

Pro norma PCR, omnia quae requiris sunt DNA polymerasis, magnesii, nucleotides, primariorum, DNA template ampliandi, et thermocycli.Mechanismus PCR simplex est ac finis: 1) duplex subductis DNA (dsDNA) calor denatured, 2) primariorum color ad fila singula DNA, et 3) primarii a DNA polymerasi extenduntur, ex duobus exemplaribus. original DNA acia.Denaturatio, furnum et elongatio processus supra seriem temperaturarum et temporum notus est unus cyclus amplificationis (fig. 1).

Quisque gradus cycli debet esse optimized pro template et primario instituto.Hic cyclus circiter XX-XL temporibus iteratur, et productum ampliatum tunc enucleari potest, typice per agarose gel (fig. 2).

Cum PCR methodus valde sensitiva et perexigua volumina ad singulas reactiones requiruntur, praeparatio magistri miscetur pro pluribus reactionibus commendatur.Dominus miscere bene misceri debet et per quot motus scinditur, ut unaquaeque reactio tantundem enzyme, dNTPs et primariorum contineat.Multae supplementa, ut Enzo Vita Scientiarum, praeterea offerunt PCR mixtiones quae iam omnia continent praeter primarios et DNA templates.

Guanine/Cytosine-dives regiones (GC-dives) provocationem in normali PC technicis rationibus repraesentant.Sequentiae GC-divites stabiliores sunt quam sequentiae cum contentis inferioribus GC.Ceterum sequentia GC-dives tendunt ad structuras secundas formandas, ut derepta loramenta.Quam ob rem , GC-fibulae duplices divites difficiles sunt ad tempus denaturationis omnino separatum.Ergo DNA polymerases non potest novum litus sine impedimento conficere.Superior denaturation temperatus hoc emendare potest, et temperaturas ad altiorem temperiem furnum et breviorem tempus furnum impedire non specificam ligationem primariorum GC-dives impedire potest.Additae reagentes augere possunt sequentium GC-dives amplificationem.DMSO, glycerolum, et adiuvant ad perturbandas structuras secundarias, quae per GC interationes causantur, et inde faciliorem reddunt separationem inter fila duplex.

Hot Satus PCR

Ampliatio non specificata est quaestio quae in PCR fieri potest.Pleraque DNA polymerases quae in PCR adhibentur opera maxime ad temperaturae circa 68°C ad 72°C.Enzyma autem potest etiam esse activa in inferioribus temperaturis, licet in inferiori gradu.In temperaturis longe infra temperatura furnum, primarii possunt non specialiter obligare et ad amplificationem non specialem ducere, etsi reactionem in glacie constituitur.Hoc impediri potest, adhibitis inhibitoribus polymerasibus, quae ab DNA polymerase dissociant, semel tantum ad certam temperiem ventum est, unde terminus calidi PCR incipiendi.Inhibitor esse potest anticorpus quod polymerases et denaturas obstringit in denaturatione initiali temperaturae (95°C typice).

Princeps Canones Polymerase

Dum DNA polymerases satis accurate ad exemplum originalem consequentiam amplificant, errata in congruentia nucleotidis fieri possunt.Mismatches in applicationibus sicut perplexitas in transcriptis truncatis provenire potest, et mistranslata vel otiosa servo amni.Ad has quaestiones evitandas, polymerases cum actione "probandi" notatae sunt et in workflui incorporatae sunt.Prima probatio polymerasis, Pfu, anno 1991 in Pyrococco furiosus notus est.Hoc Pfu enzyme 3' ad 5' exonuclease actionem habet.Cum DNA ampliatur, exonucleasus in 3' fine subiciens nucleotidas mismatches removet.Recta nucleotide tunc reponitur, et DNA synthesis pergit.identificatio sequentiarum nucleotidis falsae fundatur in ligamento affinitatis pro recto triphosphate nucleoside cum enzyme, ubi inhabilis ligatura synthesim retardat et ad rectam substitutionem permittit.Probatur actio polymerasis Pfu probatio in paucioribus erroribus in ordine finali comparato ad Taq DNA polymerase.Nuper, aliae enzymes probationes notae sunt, et modificationes enzyme originalis Pfu factae sunt ut errorem rate in DNA amplificatione ulterius reducerent.

RT-PCR

Transscriptio inversa PCR, vel RT-PCR, usum RNA in template permittit.Additus gradus deprehendendi et amplificationis RNA.RNA in contrarium transcribit in DNA complementario (cDNA), transpositis transpositis.Qualitas et puritas in RNA templates essentiales sunt pro successu RT-PCR.Primus gradus RT-PCR est synthesis hybridis DNA/RNA.Reverse transcriptase etiam munus habet RNase H, quod RNA portionem hybrid degradat.Moleculum unicum DNA subductis tunc perficitur per DNA dependens DNA activitatem polymerasis transcriptass in cDNA.Efficacia reactionis primi-lirae amplificationis processus afficere potest.Hinc in modum procedendi pcr signum cDNA ampliandum adhibetur.Possibilitas RNA in cDNA reverti per RT-PER multa commoda habet, ac praesertim pro analysi expressionis gene.RNA destituta est et valde instabilis, quae ad laborem provocativum facit.Plerumque primum gradum in qPCR inservit, qui RNA transcriptos in biologico exemplari designat.

qPCR et RT-qPCR

Quantitatis PCR (qPCR) usus est ad acida nucleica deprehendere, denotare et quantitare pro multis applicationibus.In RT-qPCR, RNA transcripta saepe transposita quantitate in cDNA primo, ut supra dictum est, transcribenda sunt, et postea qPCR peracta sunt.Ut in regula PCR, DNA ampliatur tribus gradibus repetitis: denaturatio, furnum, et elongatio.Nihilominus, in qPCR, labella fluorescentium datorum collectionem praebet sicut per progressionem.Haec ars multas utilitates habet propter amplitudinem methodorum et chymicorum promptorum.

In tinctura fundato qPCR (typice viridis), labella fluorescentium permittit quantitatem moleculis ampliatis DNA adhibendo tinguendi ligandi usum dsDNA.Singulis cyclis mensuratur fluorescens.Signi fluorescentiae proportionaliter augetur ad quantitatem DNA replicatae.Hinc est DNA quantum in tempore reali (Fig. 3).Incommoda tingendi qPCR substructio sunt tantum unum scopum ad tempus examinari posse et tinctura obligare cuilibet ds-DNA in sample praesente.

In probe-substructio qPCR, multa scuta eodem tempore in unoquoque exemplo deprehendi possunt, sed hoc requirit optimam rationemque scopo-specialis speciminis adhibiti praeter primarios.Plura genera consiliorum speciariorum in promptu sunt, sed frequentissimum genus est specillum hydrolysi, quod fluorophore et extinguente incorporat.Fluorescentia resonantiae energiae translationis (FRET) impedit emissionem fluorophori per extinctorem dum specillum integrum est.Nihilominus, per reactionem PCR, specillum hydrolyticum in prima extensione et amplificatione certae seriei tenetur.Fissio speciminis fluorophore a restinguente separat et in incremento fluorescentiae amplificationis-dependens sequitur (fig. 4).Sic, signum fluorescens e specillo substructo qPCR reactionis proportionalis est quantitati scopo speciminis, sequentiam in sample praesentem esse.Quia probe-substructio qPCR subtilius est quam fuco-substructio qPCR, saepe technicae artis usus in qPCR-substructio diagnostica pertentat.

Isothermal amplificatio

Per suprascriptas artes technicas thermocycles pretiosas requirit apparatum ad accurate conportandum et descendendum temperaturas cubiculorum ad gradus denaturationis, furnorum et extensionis.Aliquot artes excultae sunt quae tam subtilibus machinis non indigent ac perfici possunt in aqua simplici balnei vel etiam intra cellulas usurarum.Artes hae pluraliter vocantur amplificatio et labor isothermal innixa amplificatione exponentiali, lineari, cascade.

Genus ampliationis isothermal notissimum est amplificatio ansa mediata isothermal, seu LAMPAS.LAMP utitur amplificatione exponentiali ad 65⁰C ad amplificandum templates DNA vel RNA.Cum LAMPA faciendo, quattuor ad sex primarios regiones scopum DNA complementaria adhibita sunt cum polymerase DNA ad novam DNA synthesinandam.Duo ex his primariis honorificentiores habent sequentia quae sequentia in aliis primariis agnoscunt easque ligant, permittens structuram "lopis" formare in DNA noviter synthesis quae tunc adiuvat primarium furnum in subsequentibus circumscriptionibus amplificationis.LAMPA pluribus modis subjici potest, incluso fluorescente, agaroso gel electrophoresi vel colorimetry.Facilitas visualisi et detectionis praesentia vel absentia producti per colorimetry et indigentiam apparatuum pretiosarum quaeruntur LAMPA opportuna optio facta est pro SARS-CoV-2 probatio in locis in quibus lab probatio clinica praesto non erat, vel repositionis et exemplorum transportatio non factibilis, vel in labs quod antea pcr thermocyclum apparatum non habuit.