In qPCR experimentis, primarius designatio etiam magni momenti nexus est.Utrum primariorum aptae sint necne, intime coniungitur an amplificatio efficientiae ad vexillum attingat, an producta amplificata specifica sint, et an eventus experimentales praesto sint.
Quomodo igitur qPCR primario speciei melius?Maximum amplificationis efficientiam?
Hodie capiemus te ad primarios qPCR excogitandum simul, et qPCR primarium consilium efficiens fiat scientia in experimentis.
Cum qPCR primers designantes, sequentia puncta observare solent: primarii trans introns quam maxime designentur, productus longitudo 100-300 bp, valor Tm quam proxime ad LX°C, et primarii fluminis et amni quam proxime, et primi primi finis G vel C, etc expectare debet.
1. Design of primers spanning introns
Cum qPCR primers designans, primarios eligens trans introns designatos impedire potest gDNA templates augeri, et producta omnia ex amplificatione cDNA derivari, ita influxum gDNA contaminationis eliminare.
2. Longitudo primario
Longitudo prima plerumque est inter 18-30 nt et producti amplificationis longitudo inter 100-300 bp quam maxime temperari debet.
Si primarius nimis brevis est, ad amplificationem non specificam ducet, quae si nimis longa est, facile structuram secundariam (ut derepta structura).Si productum amplificationis nimis longum est, non convenit reactioni polymerase, quae efficientiam PCR amplificationis afficiet.
3. GC content et Tm valorem
Contentum primariorum GC inter 40% et 60% coerceri debet.Si nimis alta vel minor est, non adiuvat ad motus initiandos.Contentum GC primariis anterioribus et transpositis eidem propinquum esse debet ut idem Tim valorem et furnum temperiem obtineat.
Valor Tm debet esse inter 55-65°C quoad fieri potest, plerumque circiter 60°C, et Tm valor fluminis et amni debet quam proxime, potius non plus quam 4°C.
4. Vitare lectio A in III "finem primario"
Cum 3′ finis primi mismatched, magnae differentiae sunt in synthesi efficientia diversarum basium.Cum basis ultima sit A, potest etiam catenam inchoare synthesin etiam in casu mismatching, et cum basis ultima sit T Quando, efficientia inductionis misparis valde diminuitur.Quapropter evitanda eligendo A in 3′ fine primi primi, et melius est eligere T.
Si est specillum primarium, 5′ finis speciminis G esse non potest, quia etiam cum una basis G ad FAM globi notarii fluorescentis coniungitur, G etiam signum fluorescentium a globo FAM emisso exstinguere potest, quod in falsis eventibus negativis provenit.Apparere.
5. Basis distributio
Distributio quatuor basium in primo casu potius temere est, vitando plus quam 3 continuos G vel C in 3° fine, et plusquam 3 continuos.G vel C facile sunt generare connubium in regione GC divite serie.
6. Regio primarius designans structuras secundarias implicatas vitare debet.
Secunda structura per unicum litus amplificationis producti formata lenis PCR progressus afficiet.Praedicans utrum sit secunda structura in scopum sequentiarum in antecessum, hanc regionem in primariorum consilio evitare conantur.
7. Ipsi primarii et inter primores conentur consecutivas bases complementarias vitare.
Inter primum ipsum et primum non potest aliqua continuatio basi compleri.Primarius ipse consequentiam complementariam habere non debet, alioquin se complicabit ad structuram hairpin formandam, quae annales primitivae et exempli causa afficiet.
Sequentiae completivae non possunt existere inter primarios fluminis et amni.Complementaritas inter primarios primarios dimersos efficiet, quae per efficientiam reducebunt et accurate quantitatis etiam afficiunt.Si structurae primario-dimer et derepta necessariae sunt, valorem △G nimis altum esse non debet (minor erit quam 4.5 kcal/mol).
8. Primarii scopo specifica producti ampliant.
Finis ultimus qPCR detectionis est intelligere abundantiam scopo gene.Si amplificatio non specificata occurrat, quantitas inaccurata erit.Itaque, designatis primariis, ab BLAST explorari debent, et productorum proprietas in datorum serie comparatur.
Deinde sumimus humanum GAS6 (Incrementum comprehensionem specierum 6) gene in exemplum ad qPCR primarios designandi.
01 query gene
Homo GAS6per NCBI.Hic attendere debemus ut nomen generum et species comparet ut sibi constet.
02 Reperio in gene serie
(1) Si scopo series genomica est DNA, elige primum, quod est DNA genomica series gene.
(2) Sequentia scopum Si variant, elige secundum.Post intrantes deprime "CDS" in tabula infra.Sequentia in scaena coding in gene serie fusca est.
03 Design primers
Intra in primario interface
Numerum gene seriei intrant vel sequentia in forma Fasta sinistra superiori, et imple parametris pertinentibus.

Preme "primers surge" et NCBI nuntiabis tibi talem parametri electionem ampliari aliis variantibus splicibus.Possumus varias varia- tiones varias inhibere et eas submittere ut congruum primum par (ut infra in figura ostenditur).Hic processus potest capere decem secundarum ad currendum.
Temperaturae furnum harum primariorum paria sunt omnia circa LX°C.Secundum ad experimentum, elige primers cum mediocri longitudine, bona specie et minus sui complementum primers ad experimentum, et bene rate est valde alta!
04Primer speciem verificationis
Re quidem vera, praeter primarios designantes, Primer-Blast etiam primarios nosmetipsos destinatos aestimare potest.Redi ad paginam primam designationis, fluminis et amni primores intramus, quos designavimus, et alia parametri non accommodanda sunt.His submissis, videre potes an paria primariorum etiam in aliis genes existant.Si ea omnia in gene proponuntur ut amplifices volumus, ostendens magnam proprietatem huius coniugationis primariorum!(Exempli gratia, hoc solum est exitum interrogationis prioris!)

05 De primario qualitate iudicium
Qualis primarius est "perfectus" primarius, qui "amplicationem efficientiam ad vexillum", "amplificatam indolem productam" componit, et "certus eventus experimentalis"?
amplificatio efficientiam

liquescens curva
Exaggeratio primariorum efficientia attingit 90%-110%, quod significat amplificationem efficientiam bonam esse, et curva liquatio unum apicem habet et plerumque Tm>80°C, quod significat amplificationem specificitatem bonam esse.
 
Related Products:
Verus tempus PCR Securus SYBR Green I
Verus tempus PCR Securus Taqman