Ct valor maximi effectus praesentationis forma quantitatis fluorescentis PCR.Ponitur calculare differentias gene expressionis vel generum exemplum numeri.Quid ergo est Ct valor fluorescentiae quantitatis rationabilis?Quomodo efficax amplitudo Ct valoris?
Quid est Ct Precium?
Per qPCR amplificationis processum, respondent numerus cyclorum amplificationis (limen cycli) cum signum fluorescens producti ampliati pervenit ad limen statutum fluorescens.C pro Cycle et T pro Limen stat.Simpliciter positum est, Ct valor numerus cyclorum respondentium cum amplificatione templates initialis ad quandam quantitatem producti in qPCR pervenit.Sic dictum "quidam operis" postea dicetur.
Quid facit Ct valorem?
1.Relationship inter amplificationem exponentialem, template moles et ct valorem
Specimen, genes in qPCR cumulantur amplificatione exponentiali post aliquot cyclos.Necessitudo inter numerum amplificationis cyclorum et copia productorum est: Amplificati producti moles = initialis template moles (1+En) cyclorum numerus.Autem, qPCR reactio non semper est in statu ideali.Cum ampliatio producti summa attingit "quidam productum quantitatis", cyclorum numerus hoc tempore est ct valor, et in amplificatione exponentiali periodus est.Necessitudo inter Ct valorem et quantitatem principii templates: Est relatio linearis inter Ct valorem Formulae et logarithm primi exemplaris numeri Formulae.Altior initialis intentio, minor Ct valoris;inferiores massae initialis retrahitur, major in Ct valorem.
2.Amplification curva, fluorescens limina et certae quantitates producti PCR
Moles qPCR amplificationis producti directe exhibetur in forma signorum fluorescentium, id est, curvae amplificationis.In PCR praematuro gradu amplificatio sub condicionibus idealibus est, numerus cyclorum parvus est, productus cumulus parvus est, et planities fluorescentiae a curriculo fluorescentiae clare distingui non possunt.Post hoc, fluorescens tempus auget et intrat exponentialem.Moles producti PCR certo puncto deprehendi potest cum PCR reactionem in parte exponentiali tantum est, quae uti "quidam producti quantitatem" potest, et ex hoc argumento initiale Formulae deduci potest.Fluorescens igitur signum intensionis respondet quantitati productum est limen fluorescentiae.
In proximo PCR stadio, amplificatio curvae amplificationem exponentialem non amplius ostendit, et periodum linearem et regionem campestris intrat.
3.Reproducibility of ct values
Cum PCR cyclus ad numerum cycli Ct valoris pervenerit, modo veram amplificationis exponentialem periodum ingressus est.Hoc tempore, parvus error non ampliatus est, ideo reproducibilitas quantitatis Ct valoris est praeclarus, hoc est, idem template ampliatur diversis temporibus vel in diversis tubis simul.Amplificatio, adeptus Ct valorem constans.
1.Amplification efficientiam En
PCR amplificationis efficientiam refert ad efficientiam qua polymerasis genus convertit ad ampliandum in ampliconem.Efficens amplificatio cum unum DNA molecula in duo DNA molecula transmutatur, est 100%.Efficacia amplificatio vulgo exprimitur, ut En.Ad faciliorem analysin articulorum sequentium, breviter introducuntur factores, qui amplificationem efficientiam afficiunt.
| influens factors | explicatio | Quomodo iudicare? |
| A. PCR inhibitors | 1. Formulae DNA substantias continet quae per reactionem inhibent, ut servo vel purgat.2. cDNA transcriptio post transpositionem altam coniunctionem templates RNA vel RT reagentis continet, quae etiam per reactionem subsequentem inhibere potest. | 1. Utrum pollutio sit ex ratione A260/A280 et A260/A230 vel RNA electrophoresis dimetiendo iudicari potest.2. Utrum cDNA secundum quamdam rationem post transcriptionem transversam diluatur. |
| B. Impropria primario design | Primors non annea efficienter | Inprime primarios pro primario-dimers vel pepla, infortunia, et interdum consilia intronica satagunt. |
| C. Impropria pcr reactionem programmatis design | 1. Primers non efficaciter anneal2. satis emissione DNA polymerase 3. Diu terminus caliditas DNA polymerase actio decrevit | 1. Furnum temperatus altior TM valore primarii2. Pre-denaturation tempus nimis breve est 3. Tempus cuiusque gradus reactionis est nimis longum |
| D. satis mixtionem reagentia vel pipetting erroribus | In systemate reactionis, coniunctio localis PCR reactionis partium nimis alta vel inaequalis est, inde in amplificatione PCR amplificationis non exponentialibus. | |
| E. Amplicon Longitudo | Ampliconis longitudo est nimis longa, 300bp superans, et efficientia amplificatio est humilis | Reprehendo amplicon longitudo inter 80-300bp |
| F. Influence qPCR reagentia | Concentratio DNA polymerasis in regente humilis est vel ions in quiddam non optimized retrahitur, inde in Taq enzyme activitatem non attingens maximam | Determinatio amplificationis efficientiae per vexillum curvae |
2.Range of ct values
Valores ct vagae ab 15-35.Si Ct valor minor est quam 15, consideratur amplificationem intra teli basilineae tempus et limen fluorescentium non attigisse.Specimen inter Ct valorem et logarithmum relatio linearis est numeri exemplaris exemplaris, id est, mensurae curvae.Per curvam regulam, cum amplificatio efficientiae est 100%, valor calculi Ct quantitatis quantitatis singularis numerus generum est circiter 35. Si maior quam 35, exemplar initialis numerus Formulae theoretice minor est quam 1, qui inanis considerari potest.
Pro diversis gene ct iugis, ob diversitatem in gene copy number and amplification efficienting in the initial template amount, it necesse est ut vexillum curvae gene et deprehensio gena lineari calculate.
3.Influencing factores ct valorem
Ex relatione inter cyclorum amplificationis numerum et quantitatem producti: quantitatem ampliandi producti = quantitatem initialis templates × (1+En) cycli numeri, videri potest sub idealibus conditionibus, quantitatem initialis templates et En negativam in Ct valore habere affectam.Differentia in template qualitatem vel amplificationis efficientiam causabit Ct valorem nimis magnum vel parvum esse.
4.Ct valorem nimis magnum vel angustum
Post tempus: Feb-22-2023
