RT-qPCR experimentum fundamentale biologiae hypotheticae est, cuivis notum esse debet.Praecipue tres gradus includit: RNA extractionem, transpositionem in cDNA transverso, et quantitatis PCR fluorescentis temporis realis.Non adiuvat, quid agitur?Verisimile est quod Difficultas este converso transcriptio experimentum!Etsi experimentum e transpositione transpositione videtur necessarium esse ad RNA, dNTP, primers, etvicissim transcriptasead tubum centrifugium et bene miscendum, sed in ipso processu operationis, adhuc multa singularia sunt quae observanda sunt.Discamus!

Quales rna judicare?
Ad cDNA obtinendum, quale RNA criticum est!RNA qualitas maxime potest deprehendi ex duobus aspectibus;
(1) rna integritas;RNA integritas verificari potest ab agaroso gel electrophoresi. In exemplum eukaryotes sumentes, integra tota RNA tria vincula clara habet, moleculares pondera a magnis ad parvas 28S, 18S, 5S, 28S dupla lucidi ut 18S;si tres vincula videri possunt, genus autem fasciae turbatae vel diffusionis significat RNA degradatum.In hoc tempore, quaeso, statim transponendo exsequere reactionem et augere Formulam input convenienter;si modo fascia cum parvo moleculari pondere vel nulla manu videri potest, RNA degradata est et retractanda debet.Agilent 2100 RNA integritatem cum icone et RIN valore indicat.Si acidum nucleicum integrum est, baselinei electropherogramma plana est;si acidum nucleicum graviter deprimitur, basi collocantur inaequales et magis dejectiones apparent;valor RIN integritatem RNA refert, intra latitudinem 0-10, maior valor, RNA qualitatem melior.Sed quanto perfectior est gradus perfectionis.
(2) Puritas RNA:Proportio OD260/280 deprehendi potest per spectrophotometriam UV.Si proportio OD260/280 est inter 1.9 et 2.1, puritas est valde bona.
Residua genomica DNA ducere potest ad inaccuratam quantitatis eventum
RNA extracto, RNA accipimus ut cum DNA genomic (gDNA) misceri non purgatum est.Ergo cDNA transcriptio transversa etiam mixta eritgDNA.Per amniqPCRreactionem;cDNAet gDNA simul ampliari possunt, inde in valorem relativum CT parvi, unde eventus divaricari potest.
Quid ergo in hoc casu faciemus?Foregenesuggerit;
(1) Praestare genome purgationem in RNA versa, quae per columnam extractionem in RNA extractionem amoveri potest;
(II) tracta RNA cum DNaseI sed desinunt cum EDTA;
e contrario transcriptio reagentiawith genome clearing modules;

Quomodo eligere primers ad transpositionem vicissim?
Translatio primariorum inversa eventum etiam transpositionis transpositionis afficit.Temere primarios eligere potes, Oligo dT vel primarios gene-specialis pro transpositione transpositione secundum peculiares circumstantias experimenti;
(1) Imprimis transcriptsCommendatur primariis gene-specialis;
(2) Long fragment transcripts: Oligo dT/primers gene specialia commendantur;
(3) Interna fragmenta longi segmenti transcripta: gene-primers/random primers/random primers + Oligo dT.Si sequens experimentum qPCR conficitur, Oligo dT solus adhiberi non potest, quia usus Oligo dT solo 3′ finem causare potest, ducens ad eventus experimentorum parum qPCR;
(4) miRNA: Caule-loop primers seu primers tendentes adhiberi possunt.

Quotiens e contrario transcriptio producti cDNA ad quantitatem diluitur?
Obtenta cDNA translationis productum inversae, quoties cDNA diluitur experimentis qPCR magni momenti est.Si intentio cDNA nimis alta vel minor est, amplificatio efficientiae affici potest.Potestne intentio cDNA metiri, et quo modo fieri debet?
(1) In cDNA contentio producti inversi transcriptionis metiri non potest, quia, praeter cDNA productum, transumptio producta vicissim continet transcriptionem residualem Buffer vicissim transcriptasem, primariorum, etc., quae impediret cum retrahitur proventus mensurae et causa OD260/280, OD260/ 230 rationem abnormalem et ideo non reflectit veram cDNA cedunt.Hoc tempore, dicet aliquis amicus, metior coniunctio post purificationem;hic, Oblivisci velim admonere cDNA non purgari commendari, quia longitudo cDNA per conversionem alia est, et brevis cDNA in purificatione amittetur.
(2) Quid ergo?Ante experimentum qPCR, dilutio clivus cDNA per prae-experientiam determinari potest.Exempli gratia: solutione cDNA stirpis uteris, dilutio 10-triplex, et 100-triplex dilutio ut exempla pro experimentis qPCR, et factorem dilutionis cum CT valore in latitudine 18-28 elige.

Quomodo mirnm esse contrarium transcribi ?
miRNA est una parva moleculae RNA destituta cum amplitudine circiter 22 nt quae pro interdum non codice.Propter brevem longi- dinem, placitum qPCR methodus difficile est directe quantitare, ideo saepe mirnm est necessarium extendere;quae vulgariter adhibita transpositione methodi transpositionis pro miRNA methodum et modum tendentis includunt.
Methodus caulis ansa est mirna extendere addito stipite primers.Deprehensio haec methodus maiorem sensum et proprietatem habet, detectio autem throughput est humilis.Una e converso transcriptio solum unum miRNA et internum referentiam deprehendere potest;methodus caudae addens ex duobus componitur. Completur per actionem iuncturam duorum enzymorum, quae PolyA polymerase et e transpositione transcriptase sunt.PolyA polymerasis auctor est PolyA caudas ad miRNA addere ad longitudinem augendam, et transposita transcriptase transpositionem reactionem contrariam facit.Haec methodus altam detectionem habet per put et multa miRNAs et internas notiones in una vicissim transcriptione deprehendere potest, sensitivum autem et proprietas in methodo caulis humiles sunt.