PCR, multiple PCR, In situ PCR, Reverse PC, RT-PCR, qPCR（1）-PCR

Notiones, gradus et singula variarum PC explicabimus

Ⅰ. PCR

Polymerase Catena Reactio, quam PCR appellata est, technologiae biologicae hypothetica est, quae ad fragmenta specifica DNA amplificanda adhibetur.Replicari potest peculiaris DNA replicatio in vitro.DNA polymerasis (DNA Polymerase I) primo anno 1955 reperta est, et Klenow Fragmentum E. Coli, quod experimentalem valorem et prudentiam habet, a Dr. H. Klenow in primis annis 1970 repertum est, sed quia haec enzyma temperaturas non tolerat, caliditas caliditas eam potest degenerare, ideo non occurrit reactionem polymerasis cum degeneratione calidissima.Enzymae in usu hodie (Taq polymerase appellatae), a Thermo aquatico, vere calido bacterio anno 1976 segregatae sunt. Eius proprium est quod caloris caliditas resistere potest et enzyme ideale est, sed late post 1980s usus est.Conceptus originalis primitivae prototypi PCR similis est gene reparationi et exscribendae, quae proposita est a Dr. KJell Kleppe anno 1971. Primus simplex et brevis -term gene exemplar edidit (similis primis duobus cycli reactionibus PCR).PCR hodie elaboratum est a Dr. Kary B. Mullis anno 1983. Dr. Mullis PE societatibus eo anno servivit, ergo PE statum specialem in PCR industria habet.Dr. Mullis primus chartam cognatam cum Saiki et aliis anno 1985 publice edidit. Cum igitur usus PCR mille passuum in die sit, et qualis tabulae cognatae dici possunt multas alias investigationes methodos displicere dici possunt.Postmodum PCR technologia in biologicis investigationibus scientificis et in applicationibus clinicis late in usu est, cum maxima technicae investigationis biologiae hypotheticae efficiatur.Mullis etiam 1993 Praemium Nobelianum in Chemia vicit.

PCRPrincipium

Principium fundamentale PCR technologiae simile est processui replicationis naturali DNA, et eius proprietas pendet a primario oligonucleotide, quod est complementum ad utrumque scopum sequentis fines.PCR componitur e degeneratione-annealing-extendo tres principales reactiones gradus: ① Degeneratio templates DNA: Post template DNA calefit ad circiter 93°C ad certum temporis spatium, solutionem dualem DNA pro duplice catena DNA per PCR amplificationem exempli DNA relinquentem, fac eam unam catenam ut cum primore rotundo coniungi possit.② The annealing (compositum) Formulae DNA et primario: Post DNA templates in unam catenam calefactus est et degeneravit, temperatura guttae circiter 55°C.Consequentia completiva primitivalis et exempli DNA unius catenae.Extensio primitivae: DNA template-the primer binding is based on the action of TaqDNA polymerase, with dNTP as the reaction material rudis.Serva principium replicationis, compone novum exemplum catenae semi-reservatae quae complent catenam Formulam DNA, et repete cyclum degenerationis annalis extensionis tres processus plus "semi-reservatum catena exemplum", et haec nova catena denuo praesto est fieri exemplum sequentis cycli.Accipit 2-4min ad perficiendam ansam, scopum gene ampliari potest aliquot decies vicibus in 2-3 horis.

StandardPCRRatio reactionem

Quinque elementa per reactionem

Sunt principaliter quinque genera substantiarum quae per reactionem PCR, nempe primarium, enzyme, dNTP, template et quiddam (Mg2+ desideratur).[PER procedure]

Vexillum PCR processum in tres gradus dividitur

1. DNA degeneratione (90°C-96°C): Dual-catena DNA templates sub actione scelerisque, vincula hydrogenii rumpunt, unum catenam DNA efformant.

2. Annealing (25℃-65℃): Temperatura systema reducitur, primarius cum DNA template componitur ut catenam localem dual-conformet.

3. Extensio (70℃ -75℃): Sub actione Taq enzyme (circa 72°C, optima actio), dNTP adhibetur ut materia rudis, ab 5′ fine primi primi → 3′ finis, synthesis et templates DNA catenam inter se complent.

Unusquisque cyclus denatured, annectitur et extensus, duplicando contentus DNA.Nunc, propter brevem amplificationis aream, brevissimo tempore aliquid PCR replicari potest, etiamsi Taq enzyme actio non sit optima, sic mutari potest ad duos gradus, id est, furnum et extensio simul perfici potest LX°C-65°C.Ut processus levandi et refrigerandi et minuendi celeritas responsionis melioretur.

PCR reactionem features

Summus Specificatio

Speciales factores decisivorum PCR responsionis sunt: ​​① Coniunctio specifica primi et templates DNA.Principium turpium connubium.③ Fides synthesis reactionis polymerasi TaqDNA.The specificity and conservativeness of target gene.

Recta coniunctio primarum et exemplorum clavis est.Ligatio primae et Formulae et extensio catenae primae fundata est in principio adaptionis basi alcalini.Synthesis reactiones polymerasi fidelitas et caliditas resistentia Taq DNA polymerasis ut ligamentum (compositum) templates et primarium in reactione altiori temperie perfici possit.Proprietas compositionis valde augetur.Tondeo eminentiam rectitudinis ponere potest.Per eligendo scopum geneticae regionis cum magna conservativitate et alta conservativo, eius specificitas est altior.

High Sensity

Productio voluminis PCR productorum augetur indicem, qui principium exemplum Picker (PG=10-12) amplificare potest, ut microgrammatum ambitum augeat (μg= -6).Scopae cellulae ex 1 decies cellulis deprehendi possunt;in deprehensio virus, sensibilitas PCR 3 RFUs attingere potest (unitates vacuae formatae);minimum deprehensio in bacterial scientia est 3 bacteria.

Simplex et Fast

Cogitatio PCR utitur polymerase DNA summus temperatus Taq, quae solutionem reactionem uno tempore addit, id est, reactionem annalis-extensio in DNA solutionem amplificationis et aquae balnei pot.Fere amplificatio reactio perficitur in 2 ad 4 horas.Producta aucta plerumque per electricum gladium resolvuntur, nec uti isotopes, non pollutio radioactiva, et promotione facilior est.

puritas speciminis humilis est

Virus vel bacteria et cellulas culturae separare non oportet.DNA cruda producta et RNA amplifiers adhiberi possunt.DNA amplificatio detectionis directe adhiberi potest speciminibus clinicis ut sanguis, corpus liquidum, tussis lavatio fluidi, capilli, cellae et textus vivi.

PCRcommunes difficultates

Negative falsa, vincula nulla ampliatur

Clavis gradus PCR reactionis includunt: praeparatio acida nucleica templates, qualitas et proprietas primariorum, qualitate enzymorum, - PCR cycli conditiones.Ratio inveniens debet etiam per nexus praedictos resolvi et investigari.

Templates: Exemplum continet dapibus miscellaneous, ② Formula continens Taq enzyme inhibitor, ③ interdum in template non eliminatur, praesertim dapibus in chromosomate coetus.Determinator acidi nuclei degeneratio non est penitus.Cum qualitates enzymes et primariorum bonae sunt, nulla est cohortis amplificatio, quae maxime probabile est speciminum tractationem digestivam.Formulae acidi nucleici cum aliqua extrahendi processu iniquum est, ut solutionem digestionis efficax et stabilis praeparet, eius procedendi ratio fixa et non ad arbitrium mutanda est.

Enzyme inactivatio: nova enzyme vel tam veteris quam novi enzyme simul adhibenda est ad resolvendum utrum actio enzyma amittatur vel insufficiens, ad negativas falsas inducendas.Notandum quod Taq enzyme vel ethidium bromide quandoque oblitum est.

Primarius: qualitas primitivarum, concentratio primi, et an coniunctio primariorum sit symmetrica.Ratio communis est, quia per defectum vel cohortem augendam non est idealis et proclive ad diffundendum.Sunt problemata cum qualitate primariorum quorundam praepostere numerorum.Duo primarii altam intentionem habent et concentratio gravis et humilis -efficiency amplificatio asymmetrica causans.Mensurae sunt: ​​① Primarium bonum elige ad unitates componendas.② Concentratio primitivarum non solum in valore OD pendet, sed etiam ad liquidum primigenium attendit ut agaro saccharo gel electrophoresis conficiatur.Zonam primum detrahere oportet, et claritas duarum primariorum plerumque consentaneum esse debet.Cingulum, PCR hoc tempore deesse potest, et cum primario synthesi unitas resolvi debet.Si primarius altus est, splendor humilis est, et intentio eius cum diluto compensari debet.③ Primario solvendus et repositus est ad altam intentionem ne multiplex congelatio vel diuturna refrigeratio partium armarium, quae primario degeneret et degradetur.Primarii ratio irrationabilis est, qualis est insufficiens primitiva longitudo, et glomerus inter primarios formatur.

Mg2+contentio: Mg2+ion contentio magnum habet momentum in PCR amplificationis efficientia.Contentio Immodica reducere potest sexum oppositum per amplificationem.Si intentio est humilis, PCR amplificationis output etiam faciet defectum per amplificationem sine cohorte expansione.

Mutatio voluminis reactionis: Volumen quod in PCR amplificatione adhibitum est 20ul, 30ul, 50ul vel 100ul, amplissimum volumen applicationis ad PCR amplificationem positum est secundum diversos fines investigationis scientificae et probatio clinica.Post parva volumina, ut 20ul, funiculus conditionem facere necesse est cum magnitudinem faciens, alioquin deficiet.

Causae physicae: Transformatio magni momenti est ad amplificationem PCR.Si degeneratione temperatus est humilis, tempus breve est degeneratum, in falsis negativis verisimile est evenire;temperatura furnum nimis humilis causare potest amplificationem -specificam non - specificam amplificationis efficientiam reducere.Magnopere afficit coniunctio primariorum et exemplorum ad reducendam PCR amplificationem efficientiam.Aliquando necesse est utere thermometris vexillum ad deprehendendum variabilitatem, furnum et extensum temperaturam in extensione vel aqua-solubili libero, quod est una ex causis ob defectum PCR.

Scopum series variantes: Si scopum sequentias incidit, mutatio vel deletio, coniunctio prototypi et Formulae componitur, vel propter defectum scopo sequentia, primarius et exemplar consequentiam complementariam amittet, et eius amplificatio PCR non erit felix.

Falsum positivum

Cohors amplificationis PC congruere videtur cum cohortis sequentiarum scopo, et interdum eius cohors magis nitida et superior est.

Primarius designatio non convenit: sequentia amplificationis selectae et ordo amplificationis non - finis homologus est, ergo cum PCR amplificatio, PCR ampliatio producta non sunt - purposeful sequentia.Sequentia scopum brevior est vel primario brevior, et prona est ad falsam affirmativam.Redesigned opus est.

Crux pollutio scopo sequentia vel amplificatio productorum: Duae sunt causae huius pollutionis: Prima, crux -pollutio totius genome vel magnarum segmentorum, ducens ad falsas positivas.Huiusmodi falsae affirmativae his modis solvi possunt: ​​Diligenter et lenis in operatione ne scopo seriei attracto in sclopellum sclopetis vel e tubo centrifuga splendeatur.Exceptis enzymis et substantiis quae altae temperaturae sustinere non possunt, omnes regentes vel apparatus magna pressura disinfecti sunt.Tibiae centrifugae et exempla utendum uno tempore.Cum opus est, antequam specimina addantur, tubus reactionis et gerens radios ultravioletos exponuntur ad destruendum acidum nucleicum existentium.Secundo, parva fragmenta aeris pollutio.Haec parva fragmenta seriei scopo breviora sunt, sed certa homologia.Potest inter se scindi.Postquam primariis completis, productum PCR dilatetur, quod falsum productionem positivam causabit.Nidum pcr methodum reducere vel tollere potest.

Apparent non specificae amplificationis cohortis

Vincula quae apparuerunt per amplificationem cum exspectatione magnitudinis, vel magnae vel parvae, vel simul, vel simul, certae amplificationis vincula et vincula amplificationis specificae non sunt.Proventus vinculorum non specialium est: Primum, primarii incompleti sunt ad seriem scopo complementariam, vel polymerization primitivae ut glomum di formant.Secundum est quod coniunctio MG2+ionum nimis alta est, temperatura furnum nimis humilis est, et numerus PCR cyclorum relatus est.Secundo qualitatem et quantitatem enzymorum.Saepe enzymes aliquorum fontium ad vincula specialia non prona sunt et enzymes aliunde non fiebant.Interdum etiam enzymes non specificae amplificationes occurrunt.countermeasures sunt: ​​attractivas re-disposito si necesse est.Moles enzyme reducere vel repone enzyme alterius fontis.Quantitatem primariam minue, exempla convenienter auge, et numerum cyclorum minue.Furnum temperatum proprie augere vel duobus punctis temperaturae methodo utere (degenerationem 93°C, furnum et circiter 65°C extendentem).

Apparent tunsum stuppa vel linunt tape

PCR amplificatio interdum applicari videtur vel crustatum vel tapetum -sicut cingulum.Ideo, ob nimiam enzymorum quantitatem vel enzyme qualitatem, dNTP intentio nimis alta est, Mg2+ intentio nimis alta est, temperatura furnum nimis humilis est, et numerus cyclorum nimis est.Mensurae sunt: ​​① Enzymes quantitatem reducere vel enzyme alterius fontis mutare.② Reduce intentionem dNTP Mg2+ retrahitur proprie reducere.④ Formularum quantitatem auge et numerum cyclorum minue.

Related Products

PCR Heroᵀᴹ (With Dye)

Superior fidelitas: VI temporibus ordinariae Taq enzyme;

Velocius amplificationis celeritatem

More template accommodatability

Superiore amplificatione efficientiam

◮ Environmentalis tolerantia fortior est: ad 37°C per hebdomadam positus, plus quam 90% actionis conservans;

◮ Habet 5' →3' DNA polymerasium activitatem 5' →3' activitatem exonucleasam, sine 3' → 5' activitatem exonucleasam.

PCR Securus (With Dye)

Unicum reactionis systema et efficientia summus Taq DNA Polymerase faciunt per reactionem altiorem amplificationem efficientiam, specificitatem et sensibilitatem.

RT-qPCR Securus (unus gradus) -SYBR Green I

Ornamentum unum gradatim transpositionem facit et duas reactiones in eodem tubo qPCR, tantum opus est addere RNA templates, speciales PCR primarios et RNase-Free ddH.₂O.

◮ Ornamentum cito et efficaciter potest resolvere quantitatis RNA viralem seu vestigium RNA.

◮ Ornamentum singulari Foregene e contrario transcriptione reagens utitur et Foregene HotStar Taq DNA Polymerase cum unica systemate reactionis coniungitur ut efficaciter augeat amplificationem efficientiam et specificitatem reactionis.

◮ Reactionem optimized systematis reactionem efficit ut altiorem deprehensionem sensus, firmiorem stabilitatem scelerisque, et tolerantiam meliorem.

RT-qPCR Securus^TM(Gradus unus) -SYBR Green I ornamentum venit cum fuco internae relationis ROX, qui adhiberi potest ad tollendum insignem scaenam et insignes errores inter puteos, qui opportunum est clientibus uti in diversis exemplaribus quantitatis PCR instrumentis.

RT Securus^TMII (Magister Premix for primum litus cDNA synthesis forVerus tempus PCR)

- Facultas efficientis gDNA removendi, quae gDNA in template intra 2 minuta removere potest.

-Efficiens ratio transversalis transcriptionis, tantum accipit 15 minuta ad perficiendam synthesin primi litui cDNA.

- Complex templates: templates cum alta GC contenta et multiplex structura secundaria etiam cum magna efficientia converti potest.

- Maximum-sensitivum e converso ratio transcriptionis, pg-level templates etiam capere potest cDNA qualitatem alta.

- Contra transcriptionem systematis scelerisque stabilitatem altam habet, caliditas optimalis reactio est 42℃, et adhuc bona transpositionis transpositionis in 50℃ habet.