PCR (polymerasis reactionis catena) una ex vitro DNA technologiae amplificationis in- vitro cum historia plusquam XXX annorum est.

PCR technicae artis auctor Kary Mullis de Ceto, USA anno 1983 auctus est. Mullis per patentes anno 1985 applicata est ac primum PCR academicum chartam in Scientia eodem anno edidit.Mullis praemium Nobelianum in chemia in 1993 pro opere suo consideratum est.

Principia fundamentalia PCR

PCR ampliare scopum DNA fragmenta plus quam decies centena millia temporum.Principium sub catalysi DNA polymerasi est, utens parente strato DNA tamquam template et primario specifico sicut principium extensionis.Replicatur in vitro per gradus ut denaturatio, furnum, et extensio.Processus litii filiae DNA complementum ad litus template DNA parenti.

Vexillum pcr processum in tres gradus dividitur;

1.Denaturation: Utere caliditas ad separandum DNA duplex fila.Consectetuer vinculum inter DNA duplex fila in caliditate caliditatis (93-98℃) fractum est.

2.Annealing: Post DNA duplex subductis separatur, temperiem demitto, ut primario DNA unico subductis ligare possit.

3.Extensio: DNA polymerasis incipit fila complementaria synthesare per fila DNA e primariis ligatis cum temperatura demissa.Expleto extensione, perficitur cyclus, et numerus fragmentorum DNA duplicat;

Hos tres gradus 25-35 temporum reciprocus, numerus DNA fragmentorum exponentialiter augebit.

Ingenium PCR est quod diversi primarii diversis genesis scopo designari possunt, ut scopo fragmentorum generum brevi tempore ampliari possint.

Hactenus PCR in tria genera dividi potest, nempe ordinaria PCR, quantitativa PCR fluorescentis et digitalis PCR.

Prima generatio ordinariae PCR

Utere ordinario PCR amplificationis instrumento ad scopum gene augendum, tum agarose gel electrophoresis utere ad detegendum factum, modo analysi qualitativa fieri potest.

Praecipua primae generationis incommoda pcr;

1.Prone ad amplificationem non specialium et ad falsos eventus positivos.

2. Deprehensio longum tempus accipit et operatio gravia est.

3.Only qualitatem test fieri potest

Second-generatio Verus-Tempus PCR

Real-Tempus PCR, etiam qPCR notus, utitur probis fluorescentibus qui progressum reactionis systematis indicare possunt, et monitores cumulatio productorum amplificatorum per cumulum signorum fluorescentium, et eventus per curvam fluorescentiam iudicat.Quantitas potest ope Cq valoris et curvae vexillum.

Quia technologia qPCR in systemate clauso exercetur, probabilitas contaminationis minuitur, et signum fluorescens pro quantitatis detectione viverra potest, ideo in praxi clinica maxime adhibita est et dominans technologia in PCR facta est.

Substantiae fluorescentes usu reali tempore fluorescentis quantitatis PCR tempore dividi possunt in: TaqMan specillum fluorescentium, pharos hypotheticum et tinctura fluorescentium.

I) TaqMan fluorescent probe:

Per amplificationem per, specillum fluorescentium speciosum additur, addito primori par.Specillum est oligonucleotidis, et utrumque fines cum notario fluorescenti et coetus fluorescentis denotat.

Cum specillum integrum est, signum fluorescentium a notario emissum, a globo restinguendo absorbetur;in PCR amplificatione, exonuclease actionis Taq enzyme 5′3′ inhaeret et specillum deducit, faciens notario fluorescentium coetus et exstinguentis Coetus fluorescentis separatur, ita ut ratio fluorescentiae magnae fluorescentiae signum, hoc est, quotiens signum DNA multiplicatur, augeatur, multiplicatio fluorescentium cum formatione formatur, et formatio synthesis multiplicatur, et multiplicatio multiplicationis formatur, et multiplicatio multiplicationis multiplicationis multiplicatur.

2) tinctura sybrorum fluorescentium;

In systemate PC reactionis, excessus dysenteriae SYBR fluorescentis additur.Tinctura fluorescentium SYBR postquam in DNA duplicato-astra specie non incorporata est, signum fluorescentium emittit.Tinctura moleculae SYBR, quae catenae non incorporata est, nullum signum fluorescentium emittit, eoque signo fluorescenti providens. Auctum in PCR productorum, cum aucto in PCR productorum perfecte congruens est.SYBR DNA duplex subductis solum obstringit, ut curva liquatio adhiberi possit ad determinandum an PCR reactio specifica sit.

3) pharus hypotheticus;

Caule ansa duplex oligonucleotide intitulata specillum formans hairpin structuram circa 8 bases circa 5 et 3 terminos facit.Sequentiae acidi nucleici ad utrumque complementum sunt inter se pares, ut coetus fluorescentium et coetus exstinguiendi sint stricta.Prope fluorescens nulla prodibit.

Post producum PCR generatum, in annali processu, media pars pharyngis molecularis cum serie certa DNA coniungitur, et gene fluorescens separatur a gene extincto ad fluorescentiam producendam.

Praecipua incommoda secundae generationis PCR:

Sensibilitas adhuc caret, et speciminum ignobilium exemplarium detectio inaccurata est.

Est influentia rei curriculi, et effectus impedimenti susceptibilis est.

Cum PCR inhibitores in systemate reactionis sunt, eventus detectio impedimento susceptibiles sunt.

Tertia generatio digitalis PCR

Digital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) numerus exemplaris sequentis scopo per detectionem finis computat, et accurate quantitatis absolutae detectionem facere potest sine internis moderaminibus et curvarum norma.

Digital PCR deprehensio fine puncto utitur et a valore CT (liminis cycli non dependet), sic reactio digitalis PCR minus afficitur per amplificationem efficientiam, et tolerantia ad PCR inhibitores reactionem emendatur, magna diligentia et reproducibilitate.

Ob notas subtilitatis et subtilitatis altae, non facile impeditur per reactionem inhibitores, et consequi potest veram quantitatem absolutam sine norma productorum, quae investigationis et applicationis hotspot facta est.

Secundum diversas rationes unitatis reactionis, in tria principalia genera dividi potest: systemata microfluidica, spumam et stillam.

1) Microfluidic digitalis PCR, mdPCR:

Fundatur in technologia microfluidica, DNA templates separatus est.Technologia microfluidica percipere potest specimen nano-upgradationis vel generationis stillarum minorum, sed stillae speciali methodo adsorptionis indigent et tunc cum systema reactionis PC coniunctae.mdPCR gradatim ab aliis modis repone.

2) Droplet-substructio digitalis PCR, ddPCR:

Guttae aquae in oleo generationis technologiae utere ad specimen in stillicidia processus, et systema reactionem continens moleculas acidi nuclei in mille guttulis nanoscales, quarum singulae non continet scopum acidum nuclei moleculae ad detegendum, vel unum ad plura scoporum acidi nucleici moleculas probandas.

3) Chip-substructio digitalis PCR, cdPCR:

Utere technologiae viae liquidae integratae ad multas microtubas et microcavitates in lagana siliconis vel vicus vitro insculptura, et fluxum solutionis per diversa valvularum temperantia moderari, et liquidum specimen in nanometros eiusdem magnitudinis divide in puteos reactionem pro digitalis PCR Reactionem ad quantitatem absolutam consequendam.

Praecipua incommoda tertiae pcr;

Instrumenta et procurationes pretiosae sunt.

Exemplum quale requisita sunt alta.Si quantitas templates quantitatem microsystem excedit, impossibile erit quantitare, et si nimis parva est, accuratio quantitatis reducetur.

Falsi positivi quoque generari possunt cum amplificatio non specificata est.