Experimentum RT-qPCR RNA extractionem et qualitatem taxationem includit, transcriptionem transversam et qPCR tres gradus, quisque gradus multum cautiones habet, infra singillatim inferemus.

Ⅰ.RNA qualis census

In RT-qPCR experimento, RNA extractione perfecto, qualitas RNA aestimanda est, et experimentum sequens nonnisi post idoneus perfici potest.Modi aestimandi includunt spectrophotometrum, agilent gel electrophoresis, Agilent 2100 analysin, inter quas vulgo spectrophotometer et agarose gel electrophoresis methodi detectionis utuntur.Animadvertendum est has duas methodos simul adhibendas esse ad deprehensionem et analysim RNA detentionem perficiendam, puritatem et integritatem, ad invigilandum qualitatem RNA.

Related RNA Isolation Kit: 

Cell Total RNA Isolation Kit

Totalis RNA ex variis excultis cellulis multum expurgata et qualitas obtineri potest 11 min.

Animal Total RNA Isolation Kit

Celeriter et efficaciter altam puritatem et qualitatem summam RNA ex variis texturis animalis eliciunt.

Spectrophotometer:

Spectrophotometer maxime adhibetur ad intentionem et puritatem RNA determinandam, sed integritatem RNA et residuorum genomicorum deprehendere non potest.Inter eos, A260/280 et A260/230 ambitus magni momenti sunt pro RNA deprehendendi puritate, et RNA puritas deprehendi potest secundum fluctuationem bonorum suorum:

1. 1.9< A260/280< 2.1, ostendens RNA puritatem bonam esse;A260/280<1.9, indicans interdum residua in RNA esse;A260/280>2.1, significans RNA degradationem partialem possibilem, quae amplius ab agaroso gel electrophoresi confirmari potest.

2. 2.0< A260/230< 2.2, indicans RNA puritatem bonam esse;A260/230< 2.0 significans residua reagentium organicarum in RNA, ut phenola, ethanol seu saccharum exstare.

Agarosis gel electrophoresis:

Agarosa gel electrophoresis primordium potest RNA integritatem, genome et interdum residua resolvere, sed non potest accurate quantitare intentionem RNA vel residua reagentium organicarum deprehendere.Accipe eukaryotica RNA exempla pro exemplo:

1. RNA agaroso gel electrophoresi subiecta est.Si tres tantum globi ex 28sRNA, 18sRNA et 5.8sRNA in tabula gel essent, indicat extractum RNA integrum esse.Si phaenomenon trahens est, degradationem partialem indicat RNA.

2. Si unica globus nitidissimus inter gluten foramen et 28sRNA strophium est, residui genomica DNA possunt esse.

3. Si vincula in foramen gluten apparent, indicat residua interdum esse et alia substantiarum macromolecularium.

Ⅱ. Reverse transcription

Post RNA extractionem peractam necesse est in cDNA converti ad experimenta sequentia, ergo gradus versos essentialis est.Reverse transcriptio introducet from the selection of reverse transcriptase and the first;

Reverse transcriptase lectio:

Reverse transcriptases typicas includunt AMV RTase et MMLV RTase.RNAse H of AMV RTase strenuam habet actionem, brevis synthesis longitudo, summa synthesis humilis et stabilitas scelerisque bona (42~ 55℃).RNase H actio MMLV RTase infirma est, synthesis longitudo est, summa synthesis alta est, et stabilitas scelerisque pauper est (37~ 42℃).

Quia RNase H enzyme munus turpium RNA templates habet, MMLV cum RNase H actione infirmo in transpositione transpositione potissimum delectum esse debet, et post ipsum geneticum postea, scelerisque stabilitas MMLV saltum qualitativum pervenit.Subterraneis elicantes Unguibus ForegeneForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV for reverse transcription) exempli gratia, est nova transversa transcriptase expressa in E. Coli bacteria machinata utens recombinationem geneticam technologiam.Polymerasium DNA recombinans est, quod DNA lineamentum additicium facit ab uno subductis RNA, DNA, vel RNA:DNA hybrida.Nullam RNase H actionem habet, firmitatem firmissimam, affinitatem validam RNA, sensibilitatem altam deprehendendi.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV for reverse transcription)

Electio primario:

Fere primarii RT in tria genera cadunt: oligo dT, temere primers, et primers gene-specialis.Praecipuas idoneas selige ad usus secundum varias experimenta requisita.

1. Si templates eukaryoticae originis est et nuper cDNA pro amplificatione usitatum adhibetur, Oligo (dT) suadetur;Si experimentum sequens tantum pro qPCR adhibitum est, Oligo (dT) commendatus est ut cum primis temere misceatur ut efficientiam transversalis transcriptionis emendare possit.

2. Si templates ex prokaryotes, Random Primers vel genesis specificae primariorum e transpositione selectae sunt.

Ⅲ.qPCR

Quantitas fluorescens maxime elaborata est ex methodis quantitatis eligendis, principiis principalibus designationis, ROX lectio, reactionis ratio conformationis et condiciones reactionis occasus, etc.

Electio quantitatis modorum:

Modi quantitatis dividuntur in modos quantitatis relativas, et modos quantitatis absolutas.Relativa quantitas adhiberi potest ad effectum deducendi quarundam tractandi methodos in gene expressione, differentiam expressionis generum in diversis temporibus deprehendere et differentiam expressionis generum in diversis fibris comparare.Quantitas absoluta quantitatem acidi nucleici in virus et sic deinceps deprehendere potest.Cum experimenta facimus, debemus eligere methodos congruas quantitatis secundum experimenta nostra.

De primario consilio principia;

Consilium primarii pro qPCR directe refertur ad amplificationem efficientiae et producti specificitatis.Ergo bene cogitans primers bonus est primus gradus prosperitatis qPCR.In primario consilio, sequentia principia observanda sunt cum principium consilii conventionalis primoris;

1. Scopi fragmentum longitudo inter 100 et 300 bp temperata est;

2. Consilium crucis-exon vitare influentiam genomic DNA;

3. Praeceptores designati probatione indigent ad augendam efficientiam, et solum cum amplificatio efficientiae ad vexillum (90-110%) adhiberi possunt ad experimenta quantitatis;

4. Prima intentio plerumque optimized est inter 0.1uM et 1.0uM.

Electio ofROX:

In processu quantitatis reactionis, ROX viam opticam differentiam accommodare potest, erroris vel voluminis differentiam, quae per evaporationem et condensationem causatur, uniformiter emendans, iterabilitatem eventus auget.Sed notandum est lectio ROX ad instrumentum referri.Si qPCR instrumentum habet functionem sponte emendandi differentiam foraminum, non opus est ROX addere;secus, ROX correctioni addere debet.Socii parvi regentes emendi debent esse secundum instrumentum ad rectam ROX eligendam, postea errata vitanda.

Praeparatio systematis reactionis:

Reactio volumina 20ul et 50ul praeferuntur.Quae sequuntur observanda sunt cum ratio elaboratur;

1. Ratio reactionis praeparanda est evacuatione in opificiis ultra-mundanis, novis ddH₂Experimentum ad utrumque ponitur o;

2. Unumquodque experimentum debet praeparare NTC ad comprobandum num pollutio sit in systemate, et quodlibet par primariorum indiget NTC cum systema parat;

3. Ad detegendam num residuum sit gDNA in RNA template, NRT singulis specimen ad detectionem praeparari potest;

4. Cum systema parat, suadetur ut saltem 3 technicas repetat pro uno exemplo;

5. Cum template cDNA est, commendatur 5-10 diluere tempora, ut effectus inhibitionis transpositionis systematis in qPCR experimenti transpositionis minuatur.Melius est explorare Formulam quantitatis per gradientem, ut CT valor inter 20-30 cadat;

6. Determinare requisitum numerum reactionum, augere per 5-10% secundum numerum reactionum, et computare volumen configurationis numerum;

7, systema praeparatur utens principio antecedente, mixtura post centrifugationem et nullas bullas curabit;

VIII, quantum potest eligere subsidia consumabilium.

Related RT-qPCR Kit