RT-qPCR enucleatur ex technologia ordinaria PCR.Fluorescentium chymicum (fluores tingui vel fluorescentes probos) ad systema traditum PCR reactionis addit, ac processum annales et extensionem PCR in reali tempore detegit, secundum varias mechanismos lucidos.Mutationes in medio fluorescentes notae computare solent quantitatem producti mutationis in unoquoque cyclo PCR.In statu, methodi communissimae sunt tinctura methodi fluorescentis et methodi probe.

Tinctura fluorescentis methodo;
Tincturae nonnullae fluorescentes, ut SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, etc., per se non lucent, sed fluorescentiam emittunt, quae ad minorem rimam dsDNA alligandam.Ergo, in principio reactionis PCR, machina signum fluorescentium deprehendere non potest.Cum reactionem procedit ad extensionem annales (modus gradus duplices) vel scaena extensionis (modus gradus trium), fila duplici hoc tempore aperiuntur, et nova DNA polymerasis In synthesi arido, moleculae fluorescentes in dsDNA sinua minore componuntur et fluorescentiam emittunt.Cum numerus PCR cyclorum augetur, magis ac magis tingui cum dsDNA coniunguntur, et signum fluorescentium etiam continue augetur.Accipe SYBR Green Ⅰ exemplum.
Proba methodus:
Taqman specillum in hydrolysi specillo usitatius est.Est coetus fluorescens in 5′ fine specillo, plerumque FAM.Specillum ipsum est sequentia ad gene scopum complementarium.Est globus fluorescens exstinguens in 3° fine fluorophoris.Secundum principium fluorescentiae resonantiae energiae translationis (Förster resonantiae energiae translationis, FRET), cum notario fluorescentium globi fluorescentis (moleculi fluorescentis donatoris) et coetus fluorescentium extinctionis (moleculi fluorescentis susceptoris) excitatio spectri lapsi et distantia valde propinqua (7-10nm), excitatio donatoris mole- culae e acceptatione mole- culare debilitare potest.Ideo in principio PCR reactionis, cum specillum liberum et integrum in systemate est, nuntius fluorescentium coetus fluorescentiam non emit.Cum furnum, primario et specillo ligabis ad templationem.In scaena extensione, polymerasis continuos novas catenas componit.DNA polymerasis 5′-3′ actionem exonucleasem habet.Cum ad specillum pervenerit, DNA polymerasium specillum ex template hydrolyzabit, notario fluorescenti coetus a coetus fluorescentis separabit et signum fluorescentium solvet.Cum inter specillum et Formulam una relatio sit, specillum methodus murice methodo praecellit in verbis subtilitatis et sensibilitatis experimenti.

Fig 1 Principium qRT-PCR

Primarius design
Principia:

Primarii in conservata regione seriei acidi nucleici designentur et proprietatem habeant.

Optimum est sequentia cDNA uti, et mRNA sequentis quoque placet.Si minus, consilium regionis cds DNA seriei designabis.
Longitudo quantitatis fluorescentis est 80-150bp, longissima est 300bp, longitudo prima fere est inter basium 17-25, et differentia inter primores fluminis et amni non nimis magna est.

Contentum G+C inter 40% et 60% est, ac 45-55% optimum est.
Valor TM inter 58-62 gradus est.
Conare vitare primarios dimers et auto-dimersos, (ne plus quam 4 paria bases complementariae consecutivae) derepta structura, si inevitabilis, fac ΔG<4.5kJ/mol* Si non potes efficere ut gDNA remotus sit in transpositione transpositione Tersus, optimum est primarios designare intronorum *3′ finis mutari non posse, ac vitare continuos AT, T/G, non regiones divites (2-3).
specificum homologia seriei heterogeneorum ampliata potius est minor quam 70% vel basim 8 complementariam homologiam habet.
Database:
CottonFGD quaerere per keywords
Consilium de primario:
IDT-qPCR primario design

Fig2 IDT online primer design tool page

Fig3 result page ostentationem
Consilium de lncRNA primers:
lncRNA:iisdem gradibus variant.
mirna:Principium methodi caulis: Cum omnes miRNAs breves series circiter 23 nt sint, per detectionem directam perfici non potest, ideo instrumentum sequentiarum caulis ansa adhibet.Sequentia caulis ansa est una DNA subductis circiter 50 nt, quae pilorum structuram per se formare potest.3' Finis designari potest ut sequentia ad miRNA fragmenti partialis complementum, tunc scopum miRNA coniungi potest cum seriei caulis in transpositione transversali, et tota longitudo 70bp attingere potest, quae est in linea cum longitudine producti ampliati a qPCR determinato.Tailing miRNA primer design .
Deprehensio amplificatio specialium:
Online inspiratione database: CottonFGD inspiratione per seriem similitudinis
Flatus localis: Refer ad flatum utens+ ad flatum localem, linux et macos directe constituere database localem, systema win10 etiam fieri potest post decuria bash insertis.Crea inspiratione loci database et loci inspiratione;open ubuntu bash on win10 .
Animadverte: Cottona Uplandica et insula marina bombicinis tetraploidis fruges sunt, unde effectus flatus saepe duo vel plures pares erunt.Praeteritis, cum NAU cds sicut database ad inspirationem faciendam probabile est duos genes homologos invenire cum paucis tantum differentiis SNP.Fere duo genera homologa primo consilio separari non possunt, ita tractantur ut idem.Si manifesta indel est, primarius in indele solet designari, sed hoc potest ducere ad structuram secundae primitivae. Libera vis altior fit, ducens diminutionem augendi efficientiam, sed hoc necesse est.

Deprehensio primae structurae secundae:
Vestigia:open oligo 7 → input template sequence → close sub-fenestre → save → locate primer on template, press ctrl+D ut primarius longitudinis → analysis varias structuras secundarias, ut auto-dimerization corpus, heterodimer, derepta, mismatch, etc. Ultimae duae imagines in Figura 4 sunt experimenta primariorum.Effectus primarii anterioris bonus est, nulla manifesta dimer et derepta compages, nullae bases complementariae continuae, et absolutus valor liberae energiae minus est quam 4.5, cum dorsum primarium continuum monstrat 6 bases complementariae, et gratuita vis est 8.8;praeterea gravioris obscurioris in 3° fine apparet, et minor 4 basium consecutivorum apparet.Licet energia libera alta non sit, 3′ dimer Chl potest graviter afficere amplificationem specificitatem et amplificationem efficientiam.Praeterea necesse est mitra, heterodimeros et mismatches cohibere.

Fig3 oligo7 deprehensio results
Deprehensio amplificatio efficientiae:
Efficacitas amplificationis PCR reactionis PCR eventus serio afficit.Etiam in qRT-PER, amplificatio efficientiae magni momenti est pro quantitatis eventibus.Alias ​​​​substantias, machinas et protocolla remove in quiddam reactionis.Qualitas primariorum etiam magnam vim habet ad amplificationem efficientiae qRT-PCR.Ut accuratius eventus curent, tam fluorescentiae relativae quantitatis et quantitatis absolutae fluorescentiae opus est ad amplificationem primariorum efficientiam detegere.Agnoscitur efficax qRT-PCR amplificationis efficientiam inter 85% et 115% esse.Duo sunt modi:
1. modum curvae Latin;
a.Miscere cDNA
b.Diluvium gradiens
c.qPCR
d.Recessus linearis aequatio computare efficientiam amplificationem
2. LinRegPCR
LinRegPCR propositum est analysi temporis reali RT-PCR Data, etiam quantitativa PCR (qPCR) dicta data in SYBR viridi vel simili chemia.Propositum utitur notitia non-basiline correcta, baseline correctionem in unoquoque exemplo Separatim facit, fenestra-of-linearitatem determinat et deinde analysis linearis regressionis utitur ad rectam lineam per PCR statuto datam aptare.Ex clivo huius lineae PC uniuscuiusque specimen efficientia computatur.Medium PCR efficientiam per ampliconem et valorem per specimen computare solent retrahitur principium per specimen, quod in unitatibus arbitrariis fluorescentiae exprimitur.Data input et output sunt per Praecedo spreadsheet.Tantum specimen
mixtio requiritur, nullo gradiente
gradus requiruntur;(Exemplum sume Bole CFX96, non satis Apparatus ABI perspicuis)
experimentum;vexillum est experimentum qPCR.
qPCR data output:LinRegPCR duas formas imaginum outputarum: RDML vel quantitatis amplificationis effectum cognoscere potest.Revera, est realis-tempus detectio valoris numeri cycli et fluorescentiae signum a machina, et amplificatio obtinetur solutione fluorescentiae mutationis quantitatis segmenti linearis efficientiae.
Data lectio: In theoria RDML valor utilis esse debet.Aestimatur problema computatrum meum esse quod programmata RDML agnoscere non possunt, ideo valorem praecellentem habeo sicut notitia originalis.Commendatur ut rudis notitiarum protegendorum primum conficere, ut defectus exemplorum addendi, etc. Puncta in output notitiarum deleri possunt (utique ea delere non potes, LinRegPCR haec puncta in ulteriore gradu negligit)

Fig5 qPCR data export

Fig6 exempla candidatorum selectio

Data input:Aperta amplificatio absolute results.xls, → aperta LinRegPCR → lima → lego ex excello → lego parametris ut in Figura 7 → OK → deprime baselines determinare

Fig7 vestigia linRegPCR data input

Exitus:Si iteratio non est, non requiritur adjunctio.Si iteratio sit, aggregatio in aggregatione exempli edenda potest, et nomen gena in identificantis ingreditur, et tunc eadem gene in automatice aggregata erunt.Denique tabella deprime, export excellas, et eventus considera.Effectus amplificationis et R2 cuiusque eventus bene ostendentur.Secundo, si in circulos dividas, emendatio mediocris amplificationis efficacia ostendetur.Curare ut amplificatio primarii cuiusque efficientiae inter 85% et 115% sit.Si nimis magna vel minor est, significat amplificationem primitivam efficientiam pauperem esse.

Fig VIII Ex ac data output

Processus experimentalis:
RNA qualitas requisita:
Puritas:1.72.0 indicat locum isothiocyanatum residua haberi posse.Mundus acidum nucleicum A260/A230 circa 2 esse debet. Si valida effusio est 230 um, indicat compositiones organicas esse sicut phenates.Praeterea deprehendi potest 1.5% agarose gel electrophoresis.Titulum indica, quia ssRNA denaturationem non habet et pondus hypotheticum logarithmum linearem relationem non habet, et pondus hypotheticum recte exprimi non potest.Retrahitur: Theoreticallynotminus quam 100ng/ul, si intentio preme est, puritas plerumque humilis non est

Fig9 RNA gel

Praeterea, si exemplum pretiosum est et RNA concentratio alta, commendatur post extractionem aliquoti, et RNA ad finalem concentratio 100-300ng/ul extenuatur propter transpositionem inversam.Inprocessus e contrario transcription, cum mRNA transcribitur, oligo (dt) primariis quae specialiter ligare possunt ad caudas polyA transpositione adhibita sunt, cum lncRNA et circRNA temere hexamer (Random 6 mer) primers pro transpositione totalis RNA transcriptionis adhibentur pro miRNA, miRNA-specialis colli-loop primers pro transpositione transpositione adhibitae.Multae societates nunc speciales kits tendentes emiserunt.Ad modum caulis, tendentium methodus commodior est, summus throughput, et salutaris gerens, sed effectus miRNAs eiusdem familiae distinguendi non perinde esse ac ratio caulis.Utraque transcriptio aversa ornamentum habet requisita ad primarios generum specialium (stem-loops).Interna referuntur ad miRNA U6.In processu inversionis caulis, fistula U6 separanda est, et primariis U6 ante et retro directe addi debet.Utraque circRNA et lncRNA uti possunt HKGs sicut interna referentia.IncDNA deprehensio;
si cum RNA dubium non est, cDNA quoque finis erit.Attamen si experimenti perfectio subsecuta est, melius est uti interna referentia gene (Reference gene, RG) quae gDNA ab cds distinguere potest.Fere, RG est gene custodiens.HKG) ut in Figura X;In illo tempore, interdum soybean repositionis faciebam, et actin7 continentem introrsum tamquam internam referentiam faciebam.Magnitudo ampliata fragmenti huius primer in gDNA 452bp erat, et si cDNA usus erat ut a template, 142bp erat.Proventus probatus tunc invenit Partem cDNA a gDNA in actu contaminatam esse, et etiam probatum est nullum esse dubium cum ex transpositione transpositione, et ut exemplum PCR adhiberi posset.Frustra est agarose gel electronica directe currere cum cDNA, et est fascia diffusa, quod non persuadet.

Fig 10 cDNA deprehensio

Determinatio qPCR conditionibusest fere dubium secundum protocollum ornamenti, praesertim in gradu tm pretii.Si aliqui primarii non bene designati sunt in primordio, inde in magna differentia inter valorem tm et theoreticum LX°C, commendatur cDNA Post exempla mixta, clivum PCR cum primariis currere, et temperaturam sine nexibus ut TM valorem vitare conetur.

Analysis

Fluorescens relativum quantitatis PCR processus methodus conventionalis basically secundum 2-ΔΔCT.MGE template.

Related Products:

Verus tempus PCR Securus^TM -Taqman

Verus tempus PCR Securus^TM -SYBR UF I

RT Securus I (Magister Premix pro prima linea cDNA synthesis)

RT Securus II (Magister Premix pro prima linea cDNA synthesis pro qPCR)