Adauge sensus reactionem ratio：

1. segregare optimum RNA：

Prosperum cDNA synthesis est ex qualitate RNA.Qualitas RNA saltem sit plena longitudo et libera inhibitoribus aversae transcriptasis ut EDTA vel SDS.Quale RNA decernit maximam copiam notitiarum sequentiarum in cDNA transcribere potes.Communis RNA purificationis modus est unus gradus modus utendi guanidine isothiocyanate/acidi phenol.Ne contagione per vestigium copiae RNase, RNA ab RNase-dives exempla (qualia pancreatis) segregata sint, necesse est in formaldehyde conservari RNA summus qualitas, praesertim diuturnum tempus.RNA e rat hepatis extracta basically deformis erat postquam in aqua una septimana reposita erat, dum RNA e rat lien extracta stabilis manebat postquam in aqua per 3 annos reposita erat.Praeterea transcripta longiora quam 4 kb magis sensitivae ad degradationem per vestigium RNases quam parva transcripta.Ad stabilitatem exemplorum RNA conditarum augendam, RNA formam deionatam dissolui potest et in -70°C repositum.Formamide usus ad RNA conservandum vacare debet a strages RNA ignominiae.RNA ex pancreate in formamide unius anni saltem conservari potest.Cum RNA uti parat, hac methodo uti potes ad RNA praecipitandum: adde NaCl ad 0.2M et 4 vicibus volumen ethanolicum, pone ad cella temperies 3-5 minuta, et centrifugium ad 10,000×g per 5 minuta.

2. Utere RNaseH-iners (RNaseH-) e contrario transcriptase：

RNase inhibitores saepe additae sunt reactiones transpositioni transpositioni ad augendam longitudinem et cedere synthesin cDNA.RNase inhibitores in synthesi primo-strato adici debent in praesentia quiddam agentis et reductionis (ut DTT), quia processus prior ad cDNA synthesis denaturae inhibitoris, per hoc ligatum RNase solvens qui RNA degradare potest.Dapibus RNase inhibitores degradationem RNA per RNase A, B, C solum impediunt, nec RNAse in cutem prohibent, cave ne RNase ex digitis tuis adhibitis inhibitoribus usum inducant.

Reverse transcriptase catalyses conversionem RNA ad cDNA.Ambae M-MLV et AMV activitatem endogenam RNaseH praeter proprias polymeraseos activitatem habent.RNaseH activitas et activitas polymerasis inter se certant pro strato hybridico inter RNA templates et DNA primario seu cDNA extensione lito formato, et RNA strand in RNA:DNA deprimunt complexum.RNA template degradatus per RNaseH activitatem non amplius inservire potest ut substrata efficax synthesis cDNA, quae cDNA synthesis cedit et longitudo minuitur.Quare utile erit RNaseH activitatem e contrario transcriptase tollere vel multum minuere.

SuperScript Ⅱ vicissim transcriptase, RNaseH- MMLV e diverso transcriptas et thermoscripte e contrario transcriptas, RNaseH- AMV, plus et pleniorem cDNA obtinere potest quam MMLV et AMV.Sensus RT-PER per summam synthesin cDNA afficietur.Thermoscript is much more sensitive than AMV.Magnitudo productorum RT-PCR contrahitur per facultatem transversae transcriptae ad cDNA synthesinandam, praesertim cum maiora cDNAs pertractentur.Comparatus cum MMLV, SuperScrip signanter incrementum RT-PER longi fructus auxit.RNaseH-reverse transcriptase etiam thermosbilitatem auxit, ut reactionem in temperaturis altiorem quam normalem 37-42°C perfici potest.Sub proposita synthesi conditiones, utere oligo(dT) primario et 10 µCi ex [α-P]dCTP.Totalis fructus litui primi computatus est methodo TCA praecipitatio utens.Plena longitudo cDNA resolvitur per vincula magnitudinis digestae excisae et in gel agaroso alcalino numeratae.

3. Tolle incubationem caliditas in contrarium transcription.

Superior incubatio temperatus adiuvat ad structuram secundariam RNA aperire, cede reactionis augere.Pleraque enim RNA templates, RNA et primarios in 65°C sine sale incubans, in glacie refrigerationem rapidam secuti structuras secundarias eliminabunt et primers ligare permittunt.Sed quaedam exemplaria adhuc habent structuras secundarias, etiam post denaturationem caloris.Amplificatio horum difficilium exemplorum perfici potest utens ThermoScript Reverse Transcriptas et transpositio reactionem contrariam ponere ad altiorem temperiem ad amplificationem meliorem.Superiores incubationis temperaturas specificitatem augere possunt, praesertim cum primariis gene-specialis (GSP) pro synthesi cDNA adhibentur (cf. Cap. 3).Si usus GSP, curare ut Tim primariorum idem sit ac temperatus expectata incubationis.Noli uti oligo(dT) et temere primers supra 60°C.Random primariorum incubationem require in 25°C pro 10 minuta antequam crescat ad 60°C.Praeter ad superiorem transpositionem temperatus utens, specificitas etiam emendari potest per directe transferens RNA/primer mix ex 65°C denaturation temperatus ad transpositionem temperatura incubationis contrariam et addito prae-calefactione 2× reactionem mixturam (cDNA calidis-initium synthesin).Aditus hic adiuvat ne basium intermolecularis intermolecularis quae in temperaturis inferioribus accidit.Multiplex temperatura commutatione requisita pro RT-PCR simplicior fieri potest utendo cyclo scelerisque.

Tth polymerasis thermostas ut DNA polymerasis coram Mg2+ agit, et ut RNA polymerasis coram Mn2+.Calefieri potest ad maximam temperie 65°C.Attamen praesentia Mn2+ in PCR fidelitatem minuit, quae polymerasin Tth minus idoneam ad amplificationem accuratam facit, qualia sunt cDNA coniunctio.Praeter, Tth transpositio humilis habet efficientiam contrariam, quae sensum minuit, et, cum transpositio et PCR vicissim cum uno enzyme perfici possunt, motus motus sine transpositione transverso non potest comparare cDNA amplificationem productorum cum genomico DNA contaminando.Productorum amplificatio separata est.

4. Additives quae contra transcriptionem promovent.

Additiva inclusa glycerolo et DMSO additae ad synthesim reactionem primo-aciae, quae stabilitatem acidi nuclei duplicati litui minuere potest et structuram secundariam RNA dissolvere.Usque ad 20% glycerolum vel 10% DMSO addi potest, quin afficiat SuperScriptum II vel MMLV actionem.AMV usque ad 20% glycerolum sine actionis iactura tolerare potest.Ad augendum sensibilitatem RT-PCR in transumptione superscript transpositionis reactionis, 10% glycerolum addi et incubari potest in 45°C.Si 1/10 translationis e contrario reactionis productum ad PCR accedit, tunc retrahitur intentio glyceroli in reactione amplificationis 0,4%, quae PCR inhibere non sufficit.

5. RNaseH treat：

Curatio cDNA synthesis profectae cum RNaseH priore ad PCR sensus augere potest.For some template, it thought that RNA in the cDNA synthesis reaction impedire ligationem amplificationis productorum, quo in casu RNaseH curatio sensus augere potest.Generaliter RNaseH curatio necessaria est cum amplificare iam plenae longitudinis scopum cDNA templates, ut exemplum tuberosum scherosis humile II.Ad hanc difficilem formulam, RNaseH curationis signum auctum est signum a SuperScripto II vel AMV cDNA confectum.Maxime RT-PCR motus, RNaseH curatio libitum est, quia PCR denaturationis gradus in 95°C plerumque hydrolytat RNA in RNA:DNA complexu.

RNA Deprehensio Modus 6.

RT-PCR imprimis provocat cum tantum parvae copiae RNA in promptu sunt.Glycogen tabellarium in RNA solitario additum adiuvat ut cedat exemplaria parva augere.RNase-free glycogen simul addi potest ut Trizol addit.Glycogen aqua solutum est et in periodo aqueo cum RNA servari potest, ut auxilium subsequentis festinet.Ad exempla minora quam 50 mg texti vel 106 cellulis excultis, retrahitur commendatus glycogeni RNase-liberi 250 μg/ml.

Acetylated BSA addito transpositione transpositioni utens SuperScript II, augere sensum potest, et pro exiguis RNA, reducendo quantitatem SuperScript II et additis 40 unitatibus RNaseOut inhibitoris nucleasi gradum deprehensionis augere potest.Si glycogen in processu solitario RNA adhibeatur, adhuc commendatur ut BSA vel RNase inhibitor adderet cum SuperScript II utens ad transpositionem reactionem reversam.

Adauge RT-PCR proprietate

1. CND Asynthesis

Primum synthesis cDNA-stratum inchoari potest tribus modis diversis adhibitis, quorum relativa specificatio quantitatem et speciem cDNA perstringit.

Prima methodus temere certae trium modorum minimus fuit.Primarii annales ad plures sites per totum transcriptum, breves, partiales longitudinis cDNAs generantes.Haec methodus saepe usus est ad 5′ finem sequentiarum adipiscendi et ex RNA templates obtinere cDNA cum regionibus structurae secundariae vel cum sitibus terminationibus quae per transpositam inversam replicari non possunt.Ad cDNA longissimum obtinendum, ratio primariorum ad RNA in unoquoque RNA sample determinanda est empirice.Initium concentratio primariorum temere ab 50 ad 250 jectum per 20 μl reactionem pervagatum.Cum cDNA summatim perstringitur ex RNA, temere primers utens, principaliter ribosomal RNA, poly(A)+RNA vulgo electum est ut in exemplum.

Oligo (dT) primers subtiliores sunt quam temere primers.Bigenerat poly(A) caudam in 3° fine mRNAs eukaryoticae inventae.Quoniam poly(A)+ RNA circa 1% ad 2% totius RNA est, moles et intricatas cDNA multo minus quam cum primulis incertis.Propter altam specificitatem, oligo(dT) plerumque non requirit optimam rationem RNA ad primarios et poly(A)+ delectu.Commendatur uti 0.5μg oligo(dT) per 20μl systema reactionis.oligo(dT)12-18 maxime convenit RT-PCR.Systema ThermoScript RT-PC praebet oligo(dT)20 propter suam melioris stabilitatis thermas pro altioribus incubationis temperaturis.

Genera specialissima primariorum (GSP) sunt specialissima primers pro gradu transverso transcriptionis.GSP est antisense oligonucleotidis quae specialiter hybridizare potest ad sequentiam RNA scopum, dissimiles incertis primariis vel oligo(dT), quae omnibus RNAs annalium est.Eaedem regulae PC primariis designandis adhibitae sunt ad consilium GSP in transpositione transpositione transpositione.GSP eadem series esse potest ac prima amplificatio quae annales ad 3′ extremum mRNA, vel GSP ad annales amni partis primae amplificationis inversae designari potest.Pro nonnullis ampliatis subditis, plus quam unum primarium antisense ad prosperum RT-PCR designari debet quia structura secundaria scopum RNA primum ligamen impedire potest.Commendatur uti 1 pmol antisensi GSP in 20 μl primitiva synthesi reactionis.

2. Tolle incubationem caliditas in contrarium transcription.

Ut plene utantur specie GSP plenae utilitatis, res transposita cum thermosbilitate superiori adhibenda est.Reverse transcriptases themostables incubare possunt in superioribus temperaturis ad augendam reactionem stringentiam.Exempli gratia, si annales GSP ad 55°C, GSP proprietas plene non adhibeatur, si AMV vel M-MLV pro transpositione transpositione adhibita sit humili stringentia 37°C.Nihilominus, SuperScript II et Thermo Scriptum in 50°C vel in superiori portari possunt, quod producta non specialia in temperaturis inferioribus generata eliminabunt.Ad maximam specificitatem, RNA/primer mix directe ex 65°C temperatura denaturationis transferri potest ad transpositionem temperatura incubationis contrariam et addita ad mixturam reactionis praecalefactam 2× (cDNA synthesis calidi initium).Hoc iuvat ne basium intermoleculares in low temperaturis connubium impediant.Multiplices temperaturae transitus pro RT-PCR requisiti simpliciores fieri possunt utendo cyclo scelerisque.

3. Reducit genomic DNA contagione

Potentialis difficultas cum RT-PER obvenit contaminatio genomicorum DNA in RNA.Bona RNA solitudo methodo utens, ut Reagens Trizol, quantitatem genomic DNA minuet praeparationem RNA contaminantem.Ad vitandos fructus e genomic DNA deductos, RNA cum amplificatione-gradu DNase tractari potest I ad contaminationem DNA removendam ante transcriptionem reversam.DNase I digestio terminata est per exempla incubans in 2.0 mM EDTA per 10 minuta ad 65°C.EDTA magnesium iones chelate potest impediens magnesium hydrolysis RNA dependens in calidis temperaturis.

Ad amplificationem cDNA separandam ab amplificatione productorum genomicorum DNA contaminando, primarii designari possunt singulae exons annales ad separandum.PCR producta ex cDNA producta brevius erit quam illa quae ex genomica DNA contaminata sunt.Praeterea experimentum moderantum sine transpositione transpositione in singulis RNA templates fiebat ut determinaret utrum fragmentum aliquod e genomic DNA vel cDNA derivatum sit.Productum per sumptum sine transpositione transpositione derivatum est e genome.