Ⅰ. Crescite sensus reactionis ratio:

1. Qualitas RNA princeps separa;

Prosperum cDNA synthesis venit ab alto quale RNA.Qualitas RNA saltem totum longiorem curare debet nec inhibitores continet, quae enzymes non continent, ut EDTA vel SDS.Qualitas RNA maximum valorem determinat sequentis informationis quas ad cDNA transcribere potes.Generalis RNA purificationis modus est modus utendi isoocyanate/acidophenoli.Ut contagione RNase impediretur, RNA separatum ab exemplo locuples in RNase (qualis pancreatis) requirit repositionem formaldehydi ad conservandam qualitatem RNA altam, quod multo magis ad tempus repositionis est.RNA e rat iecoris extractum basically post unam septimanam in aqua repositionis degradatus est, dum RNA e rat lien extracta stabilis mansit post tres annos in aqua repono.Praeterea transcripta maiora quam 4kb magis sensitiva sunt ad degradationem RNase referendam quam parva transcripta.Ad stabilitatem exempli RNA repositionis augendam, RNA in methalmamine Ionis dissolvi potest et conditur -70 °C.Thylide usus servandi RNA not continere debet obiectum miscellaneum quod RNA abducit.RNA, quae e pancreate derivata est, in methalmamine uno saltem anno salvari potest.Cum RNA uti paratus sis, sequentibus modis ad praecipitandum RNA uti potes: adde NaCl ad 0.2m et 4 temporum volumen ethanolicum, locus temperatus pro 3-5 minuta, et 10,000 × g centrifuga pro 5 minutis.

2. Usus contra transcriptase sine actione RNaseH (RNaseH-)

RNase inhibitores saepe additae sunt reactiones transpositioni transpositioni ad augendam longitudinem et cedere synthesin cDNA.RNase inhibitor in prima catena synthesis reactionem additur in praesentia buffers et agentium reducendo ut DTT quia processus pre-cDNA synthesis inhibitoris denatures, ita ligatum RNases solvens qui RNA degradat.Dapibus RNase inhibitor solum prohibet degradationem RNA per RNAse A, B, C, et RNases in cutem ne impediant, cavendum est ne RNases ex digitis inhibitoribus adhibitis inducant.

Reverse transcriptase catalyses the conversion of RNA into cDNA.Ambae M-MLV et AMV activitatem endogenam RNaseH praeter proprias polymeraseos activitatem habent.RNaseH activitas cum polymerasi actione certat pro fila heterozygoa inter RNA templates et DNA primarios seu cDNA fila extensionis formatis, et RNA: RNA fila in complexibus DNA.RNA templates ab RNaseH degradatus activitatem non amplius adhiberi possunt ut efficax subiecta synthesis cDNA, cessus et longitudo synthesis cDNA reducendo.Quapropter activitatem RNaseH exterminandi vel valde minuendi e contrario transcriptase multum prodest.

SuperScriptⅡ e diverso transcriptase, MMLV transpositae transcriptase ex RNaseH- et thermoScript e contrario transcriptas, AMV de RNaseH- cessit plenius longitudo cDNA quam MMLV et AMV.Sensus RT-PC afficitur quantitate cDNA summatim perstringitur.Thermoscript is much more sensitive than AMV.Magnitudo productorum RT-PCR contrahitur per facultatem transversae transcriptae ad synthesinandam cDNA, praesertim cum maior Cdnas perstringens.Comparatus cum MMLV, SuperScrip signanter incrementum RT-PER longi fructus auxit.RNaseH- contrarium transcriptase etiam scelerisque stabilitatem auget, ut reactionem in temperaturis altiorem quam normalem 37-42℃ exerceri potest.Sub proposita synthesi conditiones, oligo(dT) primariorum et 10μCi [alpha-p]dCTP adhibita sunt.Tota productio primae catenae in modum TCA praecipitationis computata est.Plena longitudo cDNA resolvitur cum magnitudine-sorted detractione remotionis et computatis in gel alcalino agaroso.

3. Calorem auge conservationem caloris e contrario transcriptionis.

Superior tenens temperatura adiuvat ad structuram RNA secundariam aperiendam et incrementum motus auget.Pleraque enim RNA templates, RNA et primarium tenentes 65°C sine quiddam vel sale, dein refrigerans eas celeriter in glacie excludit structuras secundarias et primarios ligare permittit.Tamen aliqua exemplaria adhuc habent structuram secundariam, etiam post denaturationem scelerisque.Amplificatio harum difficilium exemplorum praestari potest utens ThermoScript e contrario transcriptase et ponendo reactionem transpositae in altioribus temperaturis ad amplificationem emendandam.Superiores temperaturas tenentes etiam specificitatem augere possunt, praesertim cum cDNA synthesis conficitur primariis generum specialium (GSPS) (cf. Cap. 3).Si usus GSP, fac ut Tim primi valoris idem sit ac temperatura expectata tenens.Noli uti oligo(dT) et temere primers supra 60℃.Random primariorum tenendum opus est 25℃ per 10 minutas antequam crescat ad 60℃.Praeter superiores transpositione temperaturas utens, specificitas emendari potest per RNA/primam mixtionem ex 65℃ denaturing temperatura directo transferendi ad transpositionem temperamenti tenens et addito praeheato 2× reactionem mixturam (cDNA initiationis scelerisque synthesin).Aditus hic adiuvat ne basium intermolecularis intermolecularis quae in temperaturis inferioribus accidit.Usura PCR instrumentum simplificat multas virgas temperaturas pro RT-PCR requisitae.

Tth calor polymerasis stabilitus agit ut DNA polymerasis coram Mg2+ et RNA polymerase coram Mn2+.Calorem tenere potest usque ad 65℃.Attamen praesentia Mn2+ in PCR fidelitatem minuit, quae polymerasin Tth minus idoneam ad accuratas amplificationes facit, ut cDNA exquisitis rationibus.Praeterea, Tth minus efficax est ad transpositionem transpositionem, quae sensum minuit, et cum una enzyme transpositionem et PCR contrariam efficere potest, motus motus sine transpositione transverso adhiberi non potest ad amplificata cDNA producta distinguere ab illis quae genomic DNA contaminantur.

4. Additive quod contra transcriptionem promovet.

Additio additivorum, incluso glycerino et DMSO, ad synthesim reactionis primae catenae stabilitatem acidi nucleici reducere potest duplici litui ac structuram secundariam RNA dissolvere.Usque ad 20% glycerinum vel 10% DMSO addi potest, sine afficiens activitates Superscripti vel MMLV.AMV tolerare etiam potest usque ad 20% glycerolum sine actione minuente.Ut maximize sensus RT-PCR in SuperScriptⅡ transpositione transpositione transpositione, 10% glycerolum addi et insulari potest ad 45℃.Si 1/10 producti retrotranscriptionis-reactionis ad PCR accedit, remissio glyceroli in amplificatione reactionis est 0.4%, quod non sufficit ad inhibendum PCR.

5. RNaseH processui

Sensus emendari potest per synthesim reactiones cDNA cum RNaseH priore PCR tractando.For some template, it thought that RNA in the cDNA synthesis reaction prevents binding of amplificated products, in which case the RNaseH treatment can the sensitivum augere.Fere RNaseH curatio requiritur ad amplificationem relativorum longitudinis cDNA scopo template, ut tuberosum scherosisⅡ cum exemplari parvo.Ad hanc difficilem formulam, RNaseH signum auxit, quod a superscripto seu AMV generatum est cDNA.Ut pleraque RT-PCR aperiunt, curatio RNaseH libitum est, quia 95℃ PCR insulatus gradus denaturationis typice hydrolytat RNA ab RNA: DNA complexu.

6. Improved modi deprehendendi exiguis RNA：

RT-PCR imprimis provocat cum tantum parvae copiae RNA in promptu sunt.Additio glycogeni sicut tabellarius in RNA separatione adiuvat ut proventus minutorum exemplorum augeatur.An glycogen RNAse-liberi addi potest simul ac Trizol.Glycogen solutum est aquaticum et in phase aqua manere potest cum RNA, ut in subsequenti praecipitatione subveniat.Glycogenum RNAse-liberi concentratio commendata 250μg/ml est ad exempla minora quam 50 mg textus vel 106 cellularum cultarum.

Additio acetyllata BSA ad transpositionem motus contrarios utens SuperScriptⅡ sensus augere potest, et pro exiguis RNA, reducere quantitatem SuperScriptⅡ et addere 40 unitates inhibitoris RnaseOut nucleasi deprehendendi gradum meliorem possunt.Si glycogen in RNA separatione adhibetur, additio BSA vel RNase inhibitores ad transpositionem motus contrarios utens superscripto adhuc commendatur.

Ⅱ. Auge proprietatem RT-PCR

1. cNDA synthesis

Tres modi varii methodi adhiberi possunt ut synthesis cDNA primum litus inchoaret, et relativa cuiusque methodi quantitatem ac speciem cDNA summatim attingit.

Temere primus modus est minimus specierum trium modorum.Primores annectunt pluribus locis per transcriptum ad producendum brevem, partialem longitudinis cDNA.Haec methodus saepe 5′ terminationes consequentias obtinere solebat et cDNA ex RNA templates cum regionum structuris secundariis vel cum locis terminatis, quae transversae transcriptase sunt, replicare non possunt.Ad cDNA longissimum obtinendum, ratio primariorum ad RNA in unoquoque RNA sample determinanda est empirice.Concentratio primariorum temere primorum ab 50 ad 250ng per 20µl systematis reactionis.Quia cDNA synthesis ex summa RNA utens passim primers est maxime ribosomal RNA, poly(A)+RNA vulgo electum est ut in exemplum.

Initiatio subtilius quam temere primers est.Hybridizit cum poly(A) cauda in 3° fine variantis in plerisque cellulis eukaryoticis inventis.Quia poly(A)+RNA circiter 1% ad 2% totius RNA est, moles et implicatio cDNA multo minus est quam si temere primores adhibeantur.Propter altam specificitatem, oligo(dT) plerumque optimiizationem non requirit pro RNA ad primam rationem et poly(A)+ lectio.Commendatur uti 0.5μg oligo(dT) per 20μl systema reactionis.oligo(dT)12-18 maxime convenit RT-PCR.ThermoScript RT-PCR Systema oligo(dT)20 praebet propter bonam scelestam stabilitatem et idoneam ad superiores temperaturas tenendas.

Genera imprimis primariorum specialium (GSP) sunt optimae primariae specificae pro gradu inverso transcriptionis.GSP est antisense oligonucleosides, quod specialiter hybridize cum sequentium RNA destination, magis quam omnes Rnas annales sicut temere primers vel oligo(dT).Praecepta PC primariorum designandi adhibita etiam ad designandam transpositionis transpositionem GSP reactionis adhibitae sunt.GSP eadem serie esse potest ac amplificatio primario in fine mRNA3, vel GSP in amni innexa cum primario prima amplificatione designari potest.Pro aliquibus ampliatis obiectis, necesse est plus quam unum antisense primarium designare pro felici RT-PCR, quia secundaria structura scopum RNA primum a ligatione impedire potest.Suadet uti 1pmol antisense GSP in prima catena synthesis reactionis systematis 20μl.

2. Calorem auge conservationem caloris e contrario transcriptionis.

Ut GSP specificitate plene utatur, e contra transcriptase cum magna stabilitate scelerisque adhibenda est.Calor-stabilis e contrario transcriptase insulari potest in superioribus temperaturis ad rigorem reactionem augendam.Exempli gratia, si a GSP in 55°C innegatur, proprietas GSP non plene assumitur, si transpositio transposita fit in 37°C humili rigore utente AMV vel M-MLV.Nihilominus, SuperScrip et ThermoScriptum, in 50℃ vel superiore agere possunt, quae productos non specificas in temperaturis inferioribus productos eliminat.Ad maximam speciem, RNA/primer mixtio ex 65℃ denaturation temperatus directe transferri potest ad transpositionem temperatam tenens cum additione mixtionis praeheatae 2 x reactionis (initiationis thermae cDNA synthesis).Hoc iuvat ne turpia connubia inter moleculas ad temperaturas humiles impediant.Instrumentum PCR utens simplificat multiformes transitus temperatus pro RT-PCR requisiti.

3. Reducere genomic DNA contagione

Una difficultas potentialis cum RT-PCR est quod RNA genomica DNA contaminet.Usus melioris RNA separationis methodi, ut Reagens Trizol, contaminationem genomicam DNA in RNA praeparatione minuit.Ad vitandos fructus e DNA genomic productos, RNA cum amplificatione gradus Dnas tractari potest, ut contaminatum DNA removeat ante transcriptionem transversam.Exempla in 65℃ in 2.0mM EDTA pro 10 min ad digestionem DNase terminandam retenta sunt.EDTA chelates magnesii ad impediendum magnesium RNA dependens hydrolysis quae in calidis temperaturis occurrit.

Ut ampliatum cDNA a producto genome DNA amplificationis separarem, primarii qui anneal separatim cum exon separato designari possunt.PCR producta ex cDNA producta brevius erit quam illa quae ex genomica DNA contaminata sunt.Experimentum moderatum sine transpositione transpositione adhibitum est etiam in singulis RNA templates determinare utrum fragmentum datum sit e genomico DNA vel cDNA.PCR producta consecuta in transpositione transpositione transpositione derivata sunt e genome.

Related Product

RT-PCR Securus^ᵀᴹI (Unus Gradus)

Alterum gradus ornamentum transpositionem efficit transpositionem et PCR in eadem fistula efferri.Solum addere templates RNA, speciales PCR PRIMERS et RNase-Freti ddH₂O.

- temporis analysi quantitatis RNA cito et accurate perfici potest.

- Ornamentum singulare Foregene e contrario transcriptione reagens utitur et Foregene HotStar Taq DNA Polymerase cum unica systemate reactionis coniungitur ut efficaciter augeat amplificationem efficientiam et specificitatem reactionis.

- Systema reactionis optimized reactionem efficit ut altiorem deprehendatur sensus, firmior stabilitas scelerisque, ac melior tolerantia.

RT Easy II (With GDNase) Master Premix For First-Stand CDNA Synthesis For Real Time PCR With GDNase

- Facultas efficientis gDNA removendi, quae gDNA in template intra 2 minuta removere potest.

-Efficiens ratio transversalis transcriptionis, tantum accipit 15 minuta ad perficiendam synthesin primi litui cDNA.

- Complex templates: templates cum alta GC contenta et multiplex structura secundaria etiam cum magna efficientia converti potest.

- Maximum-sensitivum e converso ratio transcriptionis, pg-level templates etiam capere potest cDNA qualitatem alta.

- Contra transcriptionem systematis scelerisque stabilitatem altam habet, caliditas optimalis reactio est 42℃, et adhuc bona transpositionis transpositionis in 50℃ habet.