1. Basica scientia (si experimentalem partem videre vis, in alteram partem directe transferre placet)
Sicut derivatio reactionis conventionalis PCR, Real tempus PCR maxime monitores mutationem quantitatis amplificationis producti in singulis cyclis PCR amplificationis reactionis in reali tempore per mutationem fluorescens signorum, et quantita- tive analyses principium templates per necessitudinem inter ct valorem et regulam curvam.
Certa notitia de RT-PCR arebaseline, fluorescens liminaetCt pretii.
| collocantur: | Valor fluorescens 3 15th cycli est baseline (basiline), quae causatur ab errore mensurae occasionaliter. |
| Limen (limen); | Refertur ad deprehensio fluorescentiae limitis opportuno statuto in regione incrementi exponentialis amplificationis curvae, fere 10 temporibus vexillum deviationis baseline. |
| CT pretii; | Est numerus PCR cyclorum cum fluorescens valor in unaquaque fistula reactionis limen attingit. Valor Ct inverse proportionalis est quantitati initialis templates. |
Communes pittacii methodi pro RT-PCR:
| methodo | commodum | defectus | harum applicationis |
| SYBR GreenⅠ | Lata applicabilitas, sensitiva, vilis et opportuna | Requisita primaria alta sunt, prona ad vincula non specialia | Apta est analysi quantitatis variorum scopo generum, investigationi de expressione gene, et investigationi de recombinantibus animalibus et plantis transgenicis. |
| TaqMan | Bonum proprietate et altum repeatability | Pretium altum est et solum ad certas metas aptum. | Pathogen detectio, medicamento resistentia investigationis gene, efficacia medicamento taxatio, diagnosis morborum geneticorum. |
| hypothetica navis | Alta species, fluorescens, humilis color | Pretium est altum, solum ad certum propositum aptum, consilium difficile, et pretium altum est. | Analysis specificae gene, SNP analysis |
2. Experimentalis gradus
2.1 Circa experimentalem aggregationem- Plures oportet esse puteos in coetu et repetitiones biologicas esse oportet.
| ① | blank imperium | Usus ad deprehendere cellam incrementum status in experimentis |
| ② | SIRNA imperium negativum (sirnae speciales non | Speciem actionis RNAi demonstra.siRNA responsionem accentus non specialem ad intentionem 200nM inducere potest. |
| ③ | Transfectio Reagent Imperium | Excludere toxicitatem transmissionis reagentes erga cellulas vel effectum in expressione scopo gene |
| ④ | sirna in scopum gene | Pulsate expressio in scopum gene |
| (libitum) | positivum sirna | Solebant Troubleshoot systema experimentum et problemata perficienda |
| (libitum) | Fluorescent imperium siRNA | Efficax transmissionis cellae cum microscopio observari potest |
2.2 Principia primarii design
| Amplificatus fragmentum magnitudine | Potius ad 100-150bp |
| Longitudo primario | 18-25bp |
| GC content | 30% -70% potius 45% -55% |
| Tim valorem | 58-60℃ |
| Sequentia | Fuge T/C continuum;A/G continua |
| III finem sequentia | Fuge GC dives vel AT dives;basis terminalis potius G vel C;est optimum vitare T * |
| Complementum | Fugiat sequentia complementaria plus quam III bases in primario vel inter duos primers |
| Specification | Utere inspiratione quaerere ad confirmandam primario proprietatem |
①SiRNA est specierum specialium, et diversorum specierum sequentia erunt diversa.
②SiRNA in pulvere siccato sarcinatum est, quod per 2-4 septimanas in cella temperatura stabiliter condi potest.
2.3 Instrumenta vel regentes, quae necesse est in antecessum praeparari
| Primario (referat internum) | Duos inter deinceps et vicissim |
| Primores (scopum gene) | Duos inter deinceps et vicissim |
| Scopum Si RNA (III denudat) | Generaliter, societas 3 ligamenta componet, et deinde unum e tribus per RT-PCR . elige |
| Translatio Kit | Lipo2000 etc. |
| RNA Rapid Extraction Kit | Nam RNA extractionem post translationem |
| Celeri Reverse Transcription Kit | for cDNA synthesis |
| PCR amplificatio Kit | 2×Super SYBR Green qPCR Magister Mix |
2.4 Quod attinet ad quaestiones quae observandae sunt in certis gradibus experimentalibus:
siRNA processuum transmissionis
1. Ad platandum, eligere potes laminam 24-bene, laminam 12-bene vel 6-bene bracteam (media RNA concentratio in unaquaque puteo 24-bene bracteae propositae est circa 100-300 ng/uL), et optimalis transfectio densitas cellularum est usque ad 60%-80% vel sic.
2. Transitus gradus ac requisita specifica stricte sunt secundum instructiones.
3. Post translationem, exempla intra 24-72 horas colligi possunt pro mRNA deprehendendi (RT-PCR) vel interdum deprehendendi intra 48-96 horas (WB)
RNA extraction process
1. praeveni contagione exogenous enzymes.Imprimis larvas et chirothecas stricte includit;usus sterilis pipette apicibus et EP tubes;aqua in experimento RNase-Free adhibita esse debet.
2. Commendatur bis facere ut in promptu suggessit ornamentum extractionis, quod vere emendare vult castitatem et cedere.
3. Vastum liquorem rna columnam tangere non debet.
RNA quantitas
Postquam RNA extracta est, directe cum Nanodrop quantitate cognoscitur, et minima lectio tam humilis quam 10ng/ul esse potest.
Reverse transcription process
1. Ob nimiam sensibilitatem RT-qPCR, saltem 3 putei paralleli pro singulis specimen constituantur, quominus Ct sequens Ct nimis differat, vel SD nimis ampla sit ad analysin statisticam.
2. Magister tabidaque non riget et saepe misce.
3. Uterque tubi/foraminis novo apice reponendum est!Noli continenter uti eodem tip pipette ad exempla addere!
4. Velum cinematographicum appositum ad 96-bene lamminam addito exemplari, necesse est cum lamella expoliri.Optimum est centrifugium antequam machinam imponat, ut liquor in muro tubi defluat et bullas aereas removeat.
Communia curva analysis
| Nulla periodus logarithmica incrementum | Forsitan alta intentio templates |
| Nulla CT valorem | Recta vestigia deprehendendi fluorescent significationibus; degradatio primariorum seu rimatorum — eius integritas a PAGE electrophoresi deprehendi potest; satis moles template; degradatio exemplorum — immunditiae vitandae inductiones et iteratae congelatio et tabida in praeparatione exempli; |
| Ct>38 | Maximum amplificationis efficientiam;pcr longum productum est;variis reactionem components degradetur |
| Linearibus curvae amplificationis | Rimatur potest ex parte deponatur crebris duratus CALEFACTO cycles vel diuturna nuditate ad lucem |
| Differentia in duplicata foraminibus maxime magna | Solutio reactionis non est plene liquefacta vel solutio reactionis mixta non est;thermae thermae PCR instrumenti fluorescent substantiis contaminatur |
2.5 De analysi
Analysis data qPCR in quantitatem relativam et quantitatem absolutam dividi potest.Exempli gratia, cellulae in coetus tractationis comparatae cum cellulis in globo moderante;
Quotiens mRNA ipsius X gene mutatur, haec quantitas relativa est;in cellulis certo numero, mRNA X gene
Quot sunt codices, haec est quantitas absoluta.Plerumque quod maxime utimur in laboratorio est modus relativus quantitatis.Fere,in II - ct modumin experimentis maxime adhibetur, adeoque hic methodus hic singillatim introducenda est.
2-ct methodus: Effectus consecutus est differentiam in expressione scopo gene in coetus experimentali relativo ad scopo gene in globo moderante.Requiritur ut amplificatio efficientiae tam generum quam generum tum generum referentiae internae prope ad 100%, et relativa declinatio 5% non excedat.
Calculi modus talis est;
et imperium coetus = ct valorem scopum gene in potestate coetus - ct valorem internum referat gene in potestate group
et coetus experimentalis = ct valorem scopum gene in coetus experimentalis - ct valorem internae referentiae gene in coetus experimentalis
CT experimentum coetus - ct imperium group
Denique computa differentiae multiplex in expressione gradui;
Mutare ovile = 2-ΔΔct (respondens munus praecellenti potentiae)
Related Products:
Cell Direct RT-qPCR ornamentum
Post tempus: May-20-2023
