Notum est in centrali dogmate RNA mediatorem transcriptionem esse inter DNA et interdum expressionem.Comparata cum detectione DNA, detectio RNA obiective potest considerare expressionem genem in organismis.Experimenta quae RNA includunt: qRT-PCR, RNA-Seq, et fusionis generum detectio, etc. Fundatur in ipsius RNA notis (anulus saccharo RNA unam globi hydroxyli liberior habet quam anulum saccharo DNA), cum magno numero RNases in ambitu coniungitur, RNA levius et facilius degradetur quam DNA.Purgamentum init, purgamentum, si RNA qualitas boni non est, eventus experimentalis inconveniens esse debet, specie inaccurata notitia vel egena iterabilitas manifestatur.Ideo magis attendendum est in processui RNA, et nexus qualitatis plus momenti est ut accuratius ac accuratius experimentorum sequentium notitiae in tuto ponantur.

Pro qualitate RNA ditionis sunt fere sequentes modi usitatius;

• Spectrophotometry
• agarose gel electrophoresis
• Agilis Bioanalyzer
• real-time fluorescent quantitatis PC
• Tinctura qubit fluorescent method

01 Spectrophotometry

RNA duplex vincula coniugavit et effusio apicem habet ad necem 260nm.Secundum legem Lambert-Beer, computare possumus RNA intentionem ab effusio cacuminis ad 260nm.Praeterea possumus etiam calculare puritatem RNA secundum rationem 260nm, 280nm et 230nm effusio cacumina.280nm et 230nm sunt effusio cacumina servo et moleculis parvis, respective.Proportio A260/A280 et A260/A230 RNA puritatis qualificati maior esse debet quam 2. Si minor est quam 2, significat interdum vel parvam moleculae contaminationem in RNA sample et iterum purificari oportet.Contaminationis fontes experimenta amni afficient, ut inhibentes amplificationem per reactiones efficientiam, ex inaccuratis eventibus quantitatis.Puritas RNA magnam vim habet in effectibus subsequentibus, ideo spectrophotometria plerumque est necessaria qualitas continentiae nexus in primo gradu experimentorum acidi nucleici.

Figura 1. Typical RNA/DNA Absorptio Imaginis

02 Agarose gel electrophoresis

Praeter puritatem, integritas RNA etiam unus ex indicibus magni momenti est ad qualitatem RNA diiudicandam.Degradatio RNA ad magnum numerum fragmentorum brevium in sample ducet, ita numerus fragmentorum RNA, qui efficaciter deprehendi et obumbrari potest, relatio sequentium reducetur.RNA integritas cohiberi potest ab electrophoresi totalis RNA in a 1% agaroso gel.Haec methodus gel te configurare potest, vel utere praefabricatis E-Gel™ Ratio integritatis probationis.Plus quam 80% totius RNA est ribosomal RNA, quorum maior pars ex 28S et 18S rRNA componitur (in systematibus mammalibus).Bonitas RNA ostendet duos vectes manifestos lucidos, qui sunt 28S et 18S vectes lucidi, respective ad 5 Kb et 2 Kb, et ratio propemodum ad 2:1.Si in statu diffuso est, significat RNA specimen degradatum esse, et suadetur ut methodo quae postea descriptus est, qualitatem RNA experiatur.

Figura 2. Comparatio degradata (lane 2) et integra RNA (lane 3) in agaroso gel electrophoresis

03 Agilis Bioanalyzer

Praeter methodum agarosam gel electrophoresis supra descriptam, quae ad integritatem RNA simpliciter et celeriter cognoscendam adiuvari potest, etiam bioanalyzer agili uti potest ad integritatem RNA determinare.Utitur compositione microfluidicorum, electrophoresis capillaribus, et fluorescentibus ad RNA attentionem et integritatem aestimandam.Utendo in algorithmo constructo ad RNA specimen analysis, bioanalyser Agilent computare potest RNA integritatis valorem, RNA Integrity Number (infra ut RIN) [1].Maior valor RIN, superior integritas RNA (1 perquam degradatus, 10 perfectissimus est).Quaedam RNA experimenta quae RNA suggerunt utendo RIN ut modulo ad qualitatem aestimandam.Summus pervestigationes sequentes (infra post NGS) ut exemplum, normas Oncomine™ Repertorium Humanum immune, quod ad deprehendere B cellam et T cellam antigenorum receptorum in Thermo Piscatoris seriei tabulae Oncomine, suadeant exempla cum RIN valoribus majoribus quam 4, efficaciora legenti et clones metiri posse (Figura 3).Plures variae commendantur diversae tabulae, et saepe altior RIN notitias efficaciores efficere potest.

Figura 3, in Oncomine™ Experimenta Immunis Repertoire Humana, exempla cum RIN majoribus quam 4 efficacius legere et T cellulas clones deprehendere possunt.2】

Sed valor RIN etiam limitationes quasdam habet.Etsi RIN altam cum qualitate NGS notitiarum experimentalium correlationem habet, specimina FFPE non apta est.FFPE exemplaria chemica diu tractata sunt, et RNA extracta plerumque valorem RIN relative humilem habet.Sed hoc non significat quod experimentorum efficax notitia minus probari debet.Ad accurate exemplorum FFPE qualitatem perpendendam, mensuris aliis quam RIN uti necesse est.Praeter RIN, bioanalyser Agilens valorem DV200 computare potest ut aestimatio parametri RNA qualitatis.DV200 modulus est qui proportionem fragmentorum quam 200 bp in RNA sample computat.DV200 melior est index FFPE qualitatis specimen quam RIN.Pro RNA per FFPE extractum altissimam habet rationem cum genesis numero, qui efficaciter deprehendi potest et diversitatem genes[3].Etsi DV200 defectiones in qualitate detectionis FFPE supplere possunt, tamen bioanalyzer Agilens problemata qualitatem in RNA samples comprehendere non potest, inter an inhibitores in exemplis sint.Inhibitores ipsi afficere possunt experimentorum amni efficientiam amplificationem et copiam notitiarum utilis minuere.Scire an in sample sit inhibitor, capere possumus methodum realem-temporis fluorescentis quantitatis PCR proxime descriptam.

04 real-time fluorescent quantitatis PC

Verus tempus fluorescens quantitatis PCR methodus inhibitores in sample non solum deprehendere potest, sed etiam quale RNA in FFPE specimenque accurate reflectere potest.Cum analysribus biologicis agilentibus comparati, instrumentorum fluorescentium quantitativa real-time magis popularia sunt in laboratoriis biologicis maioribus ob earum latiorem applicationem.Ad probandas qualitates RNA exemplorum tantum opus est ut primum vestigationes emendi vel parandae genesis internae referentiae, sicut GUSB (Cat no. Hs00939627).Sub hoc statuto primariorum, explorationum et signis (totalis RNA de intentionibus notarum) ad experimenta quantitatis absolutam deducenda, RNA fragmentum concentratio effectiva computari potest ut norma quantitatis RNA aestimationis (Functional RNA Quantitatis (FRQ) pro brevibus).In probatione NGS, FRQ exemplorum RNA invenimus relationem altissimam habere cum volumine efficax notitia.Omnia exempla maiora quam 0.2ng/uL FRQ, saltem 70% legentium efficaciter sequentiam referentiam operire possunt (Figura 4).

Figura 4, valor FRQ a fluorescentiae quantitatis methodo deprehensus habet altissimam correlationem (R2>0.9) cum notitia effectiva in experimento NGS impetrato.Linea rubra est FRQ valor = 0.2 ng/uL (log10 = -0.7).4】

Praeter exempla FFPE applicanda, methodus quantitatis PCR real-time etiam efficaciter monitorem inhibitoribus in sample potest.Exemplum addere possumus detegendi in systematis reactionis cum Imperium Internum Positivum (IPC) et ejus Assay, ac deinde quantitatis fluorescentiae effectum ad valorem obtinendum.Si Ct valorem pigri post Ct valorem in reactione nullo sample, indicat inhibitorem adesse in sample et augere efficientiam in reactione vetat.

05 Qubit tinctura fluorescens methodus

Qubit Fluorometra est vulgo parva fabrica ad acidum nucleicum concentrationis et puritatis detectionem adhibita, quae facile est operari et existere in omni fere laboratorio biologiae hypothetica.Accurate considerat intentionem acidi nucleici per detectionem et tincturam nucleici acidi-bingendi (Qubit detectio reagens).Qubit altum sensum et proprietatem habet, ac accurate RNA ad pg/µL concentratio quantitare potest.Praeter facultatem notae notae accurate quantitare intentionem acidum nucleicum, novissimum exemplar novum Thermo Piscatoris, Qubit 4.0, integritatem RNA deprehendere potest.Qubit 4.0′s RNA detectio systematis (RNA IQ Assay) integritatem RNA detegit, simul duos colores fluorescentium specificos deprehendens.Hae duae tincturae fluorescentes ad magna fragmenta et parva fragmenta RNA, respective.Hae duae tincturae fluorescentes proportio magnarum fragmentorum RNA in sample indicant, et ex eo valorem IQ (Integrity and Quality) valorem repraesentans RNA qualitatis iniri potest.Valor IQ ad exempla tam FFPE quam non FFPE applicabilis est, et magnam vim habet in subsequenti qualitate sequenti.Acceptis experimentis NGS ut exemplum, experimenta in RNA-Seq in suggestu Ione torrente facta, pleraque exemplaria cum IQ valores maiores quam 4 habuerunt, saltem 50% efficax legit (Figura 5).Comparata cum methodis detectis supra memoratis, Qubit IQ Assay non solum commodius est ad operandum et minuendum tempus (intra quinque minuta), sed etiam magnam habet rationem inter parametri IQ mensurati valorem et notitia experimentorum amni qualitatem.

Figura 5, magna est relatio inter Qubit RNA IQ valorem et provisum legit RNA-Seq.5】

Per praedictam prooemium, credo quod unusquisque sufficientem habet intelligentiam diuersarum rna qualitatis modos moderandi.In praxi, eligere potesmethodus respondentem secundum specimen generis et instrumentorum existentium.Solummodo bene moderando qualitatem RNA valemus vitare defectum experimentorum sequentium quae ex paupere qualitate exempli causantur, ita salvis temporibus pretiosis, industria et dispendio.

Productorum relatio:

Animal Total RNA Isolation Kit

Cell Total RNA Isolation Kit

references

Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: RNA integritas numeri ad valores integritatis RNA mensuras assignandas.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Oncomine Human Repertoire Repertoire User Guide (Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】 Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Quality Metrics Aestimandi RNA Derivata ex Archival Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Exemplaria, Scientiarum Toxicologicarum, Volume CLXX, Paginae 2, Augusti 2019,https://doi.org/10.1093/toxsci/