1. Coepi intellectus

In hac scaena, notiones et dictiones nonnullae comprehendere debemus, ut vitemus errores nostros ante maiores nostros, ut:

Q: Quid interest inter RT-PCR, qPCR, tempus reale PCR, et tempus reale RT-PCR?

Responde: RT-PCR contrarium est transcriptio PCR(inversa transcriptio PCR, RT-PCR), quae est late usus mutationis catenae polymericae reactionis (PCR).In RT-PCR, RNA stratorium transscriptum est in DNA complementario, quod tunc adhibetur ut exemplum amplificationis DNA per PCR.
Real-time-PCR et qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) idem sunt, utrumque reale-time quantitatis PCR, quod significat unumquemque cyclum PCR ad tempus notitias reales habere monumentorum, ergo numerus principiorum templates accurate analysin accommodari potest.

Quamvis utrumque tempus reale PCR (quantitatis PCR fluorescentis temporis reali) et transscriptio inversa PCR (transscriptio PCR inversa) abbreviata videatur ut RT-PCR, conventio internationalis est: RT-PCR proprie refertur ad transcriptionem transversam.PCR, Real-time PCR plerumque abbreviata ut qPCR (quantitative real-time PCR).

Et reale tempus RT-PCR (RT-qPCR), est e contrario transcriptio PCR cum technologia fluorescentium quantitatis.: primum ex RNA transcriptione transversa obtine cDNA, ac deinde real-time PCR pro analysi quantitatis utere (qPCR).Plerique laboratorium RT-qPCR faciunt, id est, investigationes in RNA expressio-ordinatio- nis, sic qPCR quod quisque loquitur de in officina RT-qPCR actu refert, sed noli oblivisci quod multa DNA probationes in applicationibus clinicis sunt.Analysis quantitatis, ut hepatitis B virus HBV deprehensio.

Quaeritur: Lectis multum fluorescentibus quantitatis PCR, cur auctum fragmentum intra latitudinem 80-300bp coerceri debet?

AnswerLongitudo cuiuslibet generum seriei differt, quaedam sunt plures kb, quaedam centena bp, sed tantum opus est ut producti longi- tudo sit 80-300bp, cum primariis designandis, nimium breves vel nimis longi non sunt aptae quantitatis PCR deprehensio fluorescentium.Productum fragmentum brevior est ad primario-dimer distinguendum.Longitudo primarii dimeroris circiter 30-40bp est, et difficile est discernere utrum primario-dimer an producto sit minor quam 80bp.Si fragmentum producti nimis longum est, 300bp excedens, facile deducet ad augendi efficientiam et quantitatem gene non efficaciter deprehendere.

Exempli causa, cum numeras quot homines in schola sunt, tantum opus est quot ora numerant.Idem verum est, cum genesis deprehenderis, tantum quendam ordinem gena deprehendere debes ad repraesentandum Tota series faciet.Si vis dinumerare homines, debes et os et nares, aures et vitreas dinumerare, et errare facile est.

Ad dilatandum in biologicis investigationibus multae investigationes casus a puncto ad aream sunt, quia seriei generum quarumlibet specierum longissima est, supervacaneum est et impossibile omnia fragmenta metiri, ut bacterial 16S sequen- tio, quae exsequi conservativa serie bacteria Assays numerum quendam bactriae incolarum colligere.

Q: Quid est optimal longitudo qPCR primario consilio?

AnswerFere prima longitudo est de 20-24bp, quod melius est.Sane attendendum est ad valorem TM primi cogitans primario, quia hoc ad optimal furnum temperatus refertur.Post multa experimenta probatum est LX°C meliorem esse valorem TM.Si temperatura furnum nimis humilis est, facile ad amplificationem non specialem ducet.Si temperatura furnum nimis alta est, amplificatio efficientiae relative humilis erit, apicem curvae amplificationis postea incipiet, et CT valorem morabitur.

Q: Quomodo tinctura methodi a specillo differt?

Responsio Dic modumTincturae nonnullae fluorescentes, ut SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, etc., per se non lucent, sed fluorescentiam emittunt, cum duplicatam DNA rimam duplicatam ligaturam.Ergo, in principio reactionis PCR, machina signum fluorescentium deprehendere non potest.Cum motus ad scaenam sublineationis attingit, duplex filum aperitur, et novum filum sub actione DNA polymerasi componitur, et molecula fluorescens ad rimam rimam minorem dsDNA alligat.Cum numerus PCR cyclorum augetur, magis magisque tingui componuntur cum DNA duplici subductis, et signum fluorescentium continue augetur.Modus tinctura maxime in investigationibus scientificis adhibetur.
PS: Diligenter cum experimentum agendo, tinctura humano DNA coniungenda est, diligenter eam in fluorescentem hominem vertere.

Tinctura modum (reliquit) Proba modum (recte)
PS: Diligenter cum experimentum agendo, tinctura humano DNA coniungenda est, diligenter eam in fluorescentem hominem vertere.

SYBR Green ligamentum ad fossam minorem DNA

Specillum modumTaqman specillum in hydrolysi specillo usitatius est.Est coetus fluorescens in 5° fine specillo, plerumque FAM, et ipsum specillum est successio ad scopo gene complementarium.Est coetus fluorescens exstinguens in 3° fine.Secundum principium fluorescentiae resonantiae energiae translationis (Förster resonantiae energiae translationis, FRET), cum nuntius fluorescentium globi fluorescentis (moleculi fluorescentis donatoris) et coetus fluorescentium exstinguientium (moleculi fluorescentis acceptor) excitantur Cum spectra insidunt et distantia valde propinqua (7-10nm), excitatio donatoris moleculae in molecence acceptationis fluores augere potest.Ideo in principio PCR reactionis, cum specillum liberum et integrum in systemate est, nuntius fluorescentium coetus fluorescentiam non emit.Cum furnum, primario et specillo ligabis ad templationem.In scaena extensione, polymerasis continuos novas catenas componit.DNA polymerasis 5′-3′ actionem exonucleasem habet.Cum ad specillum pervenerit, DNA polymerasium specillum ex template hydrolyzabit, notario fluorescenti coetus a coetus fluorescentis separabit et signum fluorescentium solvet.Cum inter specillum et Formulam una relatio sit, specillum methodus murice methodo praecellit in verbis subtilitatis et sensibilitatis experimenti.Specillum methodi maxime in diagnosi adhibetur.

Q: Quid est quantitas absoluta?Quid est quantitas relativa?

Answer: Quantitas absoluta refert ad calculum exemplaris exemplaris numeri experimenti per qPCR probati, quales sunt quot HBV virus in 1ml sanguinis.Effectus relativi quantitatis consecutus est mutatio quantitatis scopo gene in specimine specifico relativo ad aliud specimen refertivum, et expressio gene-regulata vel deorsum instituta est.

Q: Num moles RNA extractionis, transpositionis transpositio efficientiae, et amplificationis efficientia afficiunt eventus experimentales?
Q: Num repositionis specimen, extractionem reagentium, transpositionem reagentium inversam, et consumables transmittentes leves eventus experimentales afficiunt?
Q: Quis modus experimentalis notitia corrigere potest?

Quibus de rebus singillatim in sectionibus provectis et provectis infra describemus.
2. Provectus scientia

Quod attinet ad realem temporis fluorescentis quantitatem PCR, agnoscendum est quod mille tabulae investigationis scientificae quotannis divulgantur, inter quas quantitatis PCR technologiae fluorescentis non parvus numerus est.

Si vexillum commune non est ad experientiam quantitatis fluorescentis metiendam, eventus late variari possunt.Eadem enim gene, eiusdem speciei, eadem processus methodo, detectio eventus late etiam variabit, et difficile erit eosdem nuper advenas repetere.Nemo scit, quod rectum sit, quod nefas est.

Hoc significat quantitatis PCR fluorescentium est technologia fraudator vel technicae incertae?Nequaquam, quia fluorescentis quantitatis PCR sensibilior et accuratior est, et aliquantulum iniuriae operatio effectus contrarios omnino producet.Parum detrimentum mille passuum.Articuli auctor ab reviewers identidem torqueri potest.Eodem tempore recognitores ephemerides etiam difficiles sunt ex diversis eventibus experimentalibus eligendis.

Omnino defectum consensus in real-time per experimenta demonstrans.Ad hoc, industria seniores docti signa exponere coeperunt;requirunt contributores ad aliquas necessarias experimentales et processus notitias (including datas necessarias) in articulo ad haec signa occurrere.

Recognitores explorare possunt qualitatem experimenti in singulis legendis;futuri etiam lectores hoc uti possunt ad experimentum iterare vel experimentum emendare.Tunc eventus experimentales hoc modo consecuti sunt pleni informationis, magni momenti, et vtibiles.

MIBBI (Minimum Informationes investigationum biologicarum et biomedicarum -http://www.mibbi.org) factum est.MIBBI consilium est quod experimentis signa praebet.Editum est in natura.Hoc consilium variis experimentis biologicis intenditur, inter cellam biologiam, Microarray, qPCR nunc tractaturi sumus, etc., et unicuique experimenti genus praebet cum manuscriptis exhibendis.Quod omni tempore provideatur.

In MIBBI projecto exstant duo vasa ad quantitatis PCR fluorescentium pertinentia, scilicet:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) - lingua structa et ductor renuntiationis quantitatis PCR temporis realis notitia;
·MIQE (Minimum Information pro publicatione quantitatis Real-Time PCR Experimentorum) - minimam informationem ad libellos articulos circa experimenta real-time quantitatis PCR.
Primum, de RDML fama, specificatione terminologia.

Si nulla definitio norma est omnium, impossibile est continuare disputationem, quam ob rem explicatio nominum tam magni momenti est in ipso.
Vocabularium usus quantitatis PCR in fluorescentibus experimentum hoc contentum includit.QIAGEN optimam summam nobis fecit.Haec sunt omnia aridabona .

amplificatio curva
Ampliatio curva refert curvam per processum PCR factum, cum numero cycli ut abscissae et fluorescentiae realis-temporis intensio per reactionem ut ordinatae.

Egregia curva amplificatio habere debet notas sequentesFundamenta plana sunt vel leviter diminuta, nullaque sursum inclinatio patet;Declinatio punctum curvae patet, et clivus Phase exponentiae proportionalis est efficientiae amplificationis.Quo maior est declivis, tanto efficaciae altioris amplificatio est;Parallelismus bonus est, significans amplificationem cujusvis tubuli similem esse efficientiam;patet pars exponentialis amplificationis curvae humilis-concentrationis.

Baseline (Baseline)
In baseline est strepitus gradu primi cycli, plerumque inter cyclum 3 et 15 metiri potest, quia fluorescens valor augendi per amplificationem producti causatus hoc tempore deprehendi non potest.Numerus cyclorum ad baseline rationem computandi variari potest et minui necesse est si summae templates summae adhibeantur vel si expressio gradus scopo gene excelsus sit.

Fundamentum collocare requirit inspiciendi fluorescentiam datam e linearitate amplificationis curvae.In basi collocatur ut incrementum amplificationis curvae a cyclo numero majore incipiatur quam numerus cycli baseline.Baselines necesse est ut singulae singulae scopum ordine exsequantur.Mediocris valorum fluorescens in primis cyclis deprehensis subtrahi necesse est e valoribus fluorescentiis in productis ampliatis habitis.Novissimae versiones variarum Real-Time PCR programmae latae optimiizationis fundarum baselinearum pro singulis exemplaribus admittunt.

In primis paucis cyclis PCR reactionis amplificationis, signum fluorescens multum non mutat.Accedens linea recta dicitur baseline, sed si primos cyclos inspiciamus, videmus intra basin collocari id quod in tabula infra agitur.

Background Maecenas vitae refers to
valorem fluorescens non specifica in reactione.Verbi gratia: inhabilis fluorescentium exstinguentio;vel magnus numerus exemplorum DNA subductis ob usum SYBR Viridis.In background elementa signi mathematice removentur a algorithmo reali-Tempore PCR programmatis.

Notario signum
Notario signum refertur ad signum fluorescentium a SYBR viridi generatum vel fluorescenter intitulatum per explorationes speciales per Vera-Tempus PCR.

Normalised AUCTOR signum (RN)
RN refert ad intensionem fluorescentiae notarii tinctura divisam ab intensione fluorescentiae passivae referentiae tingui mensurati in quolibet cyclo.

Passive Reference Dye
In quibusdam Vera-Tempus PCRs.fluorescent tinctura ROX adhibetur ut internum ad normalize fluorescent signum.Emendat variationes propter inaccurate pipetting, bene positionem, ac fluorescentiam fluctuationes in bene bene fundamento.

Fluorescens limina (limen)
supra valorem curriculi adaequatum et signanter sub planitie valoris amplificationis curvae.Jacere debet in regione lineari amplificationis curvae, repraesentans range log lineari PCR detectionis.Limina in curvis log-ampliificatione apponantur ita ut pars log-linearis PCR facile cognoscatur.Si plures scopo genes in real-time PCR sunt, limen pro singulis scopo apponi debet.Fere, signum fluorescens primi 15 cycli PCR reactionis adhibetur ut signum fluorescens background, et fluorescens limen est 10 temporibus vexillum deviatio fluorescentiae primi 3 ad 15 cyclorum PCR, et fluorescens limen in exponentiali periodo ampliationis PCR.In genere, unumquodque instrumentum habet sui fluorescentiam limen ante usum appositum.

Limen exolvuntur (CT) vel transitus (CP)
Cyclus ad quem amplificatio curva limen transit (id est, in quo deprehensio fluorescens signanter auget).CT fraction et moles principii templates iniri potest.Valor CT numerus cyclorum periti repraesentat, cum signum fluorescentium in singulis per fistulam reactionem in limine statuto attingit.Est relatio linearis inter CT valorem cuiusque templates et logarithmum exemplaris primi exemplaris numeri Formulae, thealtior numerus exemplaris initialis, minor CT valoris, et vice versa.Vexillum curvae fieri potest utendo vexillum cum numero notarum exemplarium initialium, in quo abscissa valorem CT repraesentat, ordinatim vero logarithmum numeri exemplaris initialis repraesentat.Quamdiu ergo CT valorem exempli ignoti obtinetur, numerus exemplaris initialis ex linea curva computari potest.

CT valorem
CT valorem describiturdifferentiam scopo gene et congruentem endogenous referat gene CT valorem, ut est genus domesticum, et ad normalize quantitatem templates adhibetur;
⇒CT = CT (scopus gene) - CT (genus endogenous reference)

CT Value
Valor -CT describit differentiam inter medium -CT valorem exempli faenore (eg, cellae excitatae) et medium valorem relationis specimen (exempli gratia cellae excitatae).Specimen relationis etiam vocatur specimen calibrationis et omnia alia exempla ad hanc quantitatem relativam normalizatae sunt;
⇒-CT = mediocris -CT (specimen interest) - mediocris -CT (referat specimen)

genes endogenous reference (endogenous reference genes)
Locutio gradus endogenorum genesis referendi, ut genes domestici (gena custodiens), inter exempla non differunt.Comparando CT valores generum referentis ad scopum gene permittit expressionem plani scopo gene normalizari ad quantitatem input RNA vel cDNA (vide sectionem supra valores CT).

Internum referat ad rectam genespotest RNA degradatio vel praesentia enzyme inhibitores in RNA exempla, necnon variationes in RNA content, transpositio efficientiae inversae, recuperatio acidi nucleici et tractatio specimen.Optimam referentiam gene(s) eligere, algorithmum modificavimus ut suam electionem optimalis referentiae ab experimentali occasu pendentem permitteret.

Internum imperium
Consequentia moderatio quae in eadem reactione cum scopo sequentia ampliatur et alio specillo probata est (id est duplex PCR faciendo).Internae moderatores saepe ad amplificationes omissis imperare consueverunt, quales cum sequentia scopum non deprehendimus.
Calibration Sample
Specimen relativum (exempli gratia purgatum RNA ex linea vel texta cellula) adhibita quantitate relativa ad omnia alia exempla comparanda ut relativum expressionis gradum gene.Specimen calibrationis potest esse aliquod specimen, sed plerumque moderatio (exempli gratia, specimen increatum vel specimen ex tempore nullius experimenti).

Positivum imperium
uti imperium profectaenota copia template.Moderatores positivi saepe ad reprimendum adhibita primario instituto vel primario-probato recte laborat et reactionem recte constituitur.

Nulla Formula Imperium (NTC)
Reactionem controlalem quae continet omnia necessaria amplificationis reactionis elementa excepto template, quod cum aqua reponi solet.Usus NTC contaminationem invenire potest ex contagione vel aliena DNA gerens, ita ut veritas et fides deprehensionis notitiae prospiciant.Amplificatio potestatis NTC contaminationem indicat.

Nulla RT imperium (NRT)
RNA processus extractionis genomic DNA residua continere potest, quod maxime nocet et reus est notitiae qualitatis afficiens et hostis naturalis qPCR, cum experimenta designans, ad solam detectionem RNA amplificandam designari debet.Duae sunt viae, una primers trans intronas designare, altera DNA penitus removere, qua una melior, de qua postea dicetur.Imperium NTR est speculum magicum ad pollutionem DNA deprehendendam.Si amplificatio, significat pollutio.

Signa
Signa sunt exemplaria notarum concentrationis vel numeri exemplarium qui ad curvam regulam construendam adhibita sunt.Ut stabilitas vexillum curare solet, fragmentum gene in plasmide obsitum esse solet et pro vexillo adhibetur.

Vexillum curvae
fere diluuntur in graduum concentrationis saltem quinque cum productum vexillum secundum rationem duplicatam, et puncta 5 trahuntur in coordinatis numerorum CT valoris et exemplarium, et puncta connectuntur ad lineam formandam ad curvam regulam generandam.Utraque curva norma, eius validitas sedanda est.Scopus valor inter -3.3 et -3.8 cadit, et utraque intentio in triplicata perficitur.Puncta signanter ab aliis punctis diversa abiicienda sunt.Valor CT specimen probandi in curvam regulam deducitur, et expressio gradus exempli explorandi iniri potest.

Exemplar CT valor probandi in curva mensura deducitur, et numerus exemplaris probati initialis iniri potest.

Effectus et Clivo
Scopuli vexillum curvae efficientiam temporis realis-PCR significat.
· Scopus -3.322 indicat PCR amplificationis efficientiam esse 1, vel 100% efficientem, et quantitatem PCR producti in singulis cyclis duplicare.
· Clivus minus quam -3.322 (eg, -3.8) indicat PCR efficientiam
· Clivus maior quam -3.322 (eg, -3.0) indicat PCR efficientiam maiorem esse quam 100%, quae curiosa esse videtur, quomodo unus cyclus PCR plus quam duplum productum ampliatum generare potuit?Haec res in non-linearibus PCR reactionis periodis occurrit, hoc est, magna copia amplificationis non specificae.

liquescens curva
Post qPCR amplificatio completur, productum PCR calefit.Cum temperatura oritur, duplex amplificatio producti subductis paulatim liquescit, inde in diminutione in intensio fluorescentiae.Cum temperatura certa (Tm) ventum est, magnus numerus productorum tabescet.Fluorescens acrius guttae.Diversi PCR producti diversos Tm valores habent et diversae temperaturas liquefacientes, ut specificitas PCR invenire possit.

Curvam liquescens (curva derivativa)
Curva liquescens derivatur ad tabulam apicam formandam, quae magis intuitive situm PER FRAGMENTA FRAGMENTA EXERCERE potest.Cum temperatura liquatio sit Tm valor fragmenti DNA, nonnulli parametri, qui Tm valorem fragmenti DNA afficiunt, iudicari possunt, qualia sunt magnitudo fragmenti, GC contenta, etc. Fere, secundum principia prima designata;producti ampliati longitudo est in latitudine 80-300bp, ita temperatura liquatio sit inter 80°C et 90°C.

Curva liquescens interpr: Si apicem solum principale inter 80°C-90°C apparet, significat quantitatem fluorescentium PCR perfectam esse;si cacumen praecipuum inter 80°C-90°C apparet et cacumina miscellanea infra 80°C apparent, prima dimer radicaliter consideratur.Furnum temperies augere potes ut eam solvas;si cacumen principale inter 80°C-90°C apparet, et apicem miscellaneum iterum oritur, cum siccus oritur, plerumque censetur DNA contaminationem esse, et DNA removeri debet in experimenti rudimento.

Utique sunt quaedam condiciones abnormes, quae singillatim infra fractae erunt.
3. Provectus scientiam

Facere qPCR, MIQE dicere habeo;Minimum Informationpro publicationequantitatisVerus tempus PCRExperimenta - minimam informationem pro articulis edendis circa realem - temporis quantitatis PCRexperimenta .Ut uniuscuiusque intellectum simpliciorem reddamus, contentum clavem simpliciorem reddemus.

Potes textum primigenium MIQE in interreti quaerere et maximi momenti est quod stipulaturGenus notitia quod provideri debet cum an articulus edendo .

Recognitores explorare possunt qualitatem experimenti in singulis legendis;futuri etiam lectores hoc experimento repetere vel emendare possunt.
Notatu dignum est in hoc indice, momentum cuiusque indices cum E vel D respective signatum esse.Quid est hoc?E: informationes essentiales (subici debent);D: desiderabilia informationes (provide quam maxime).

MIQE (1)-Experimental Design
Multi scumbags qui defensionem suam compleverunt, studiis graduatis absolutis, experimentum independenter excogitare nesciunt, commentarios aperiunt, et faciunt quod magister se facere iubet.Quam ob rem consilium experimentale non severum fuit, et editorialis emporium dixit se hanc imaginem et illam picturam conficere voluisse, ita in stupore fecit.Sic fiunt scumbags!

Propius domum, primum experimenti principium est determinarerigor experimentalis logicae.Maxime fundamentalis res experimentalis est consilium, et potissima res circa experimentalem rationem est quam ut scopum specimen, specimen (imperium), et numerum repetitionum constituat, ut notitia experimentalis referatur, comparabilis et persuadeat.

In scopum samplerefert ad specimen quod nos requirit ut gene scopum deprehendere post quamdam curationem.Quod specimen referatspecimen est sine ulla curatione, quod saepe ad genus silvestre in biologia refertur.

Experimentum replicatmagni momenti sunt.Fere numerus replicationum persuasivarum debet esse plus quam tres.Distinguendum est quid sit replicatio biologica et quid replicatio technica.

Replicates biologicae: Idem experimentum verificationis factum cum diversis materiis (tempore, plantis, batches, reactione catillis).

Biologica duplicatio
Piperis curationem in exemplum sumamus.Pesticidas imbres in tribus plantis ABC volumus, deinde tres plantae ABC tres replicationes biologicae sunt, et idem experimentum verificationis cum diversis materiis evecti sunt.Sed ut experimentum, moderatio certae necessitatis est, ita possumus unum e ramis plantae A spargere, ut experimentalem plantae coetus formare A, et alios ramos plantae A non imbre coetus moderari formare possit.Idem faciunt B, C.

Technical Replicates (Replicates Technical): iteratum est experimentum ad vitandum errores operandi causatos, quod actu duplicatum in eadem materia inclusum est.Ambae curationes et potestates debent habere occasus replicare (minimum tres) scopo gene et gene referentia interna.

Repetitio technica
Item piper pesticides tractata in exemplum.Pro coetus experimentalis plantae A, fecimus tria per foramina 1, 2, et 3 ad scopum suum gene et internum referentia gene respective, ita ut post detectionem medium accipiamus.Pro potestate plantarum A Groups eodem modo tractantur.Similiter in plantis B et C similiter faciunt.Haec est technica repetitio.

Notatu dignum estquod statisticum intrat, repetitio biologica est, et repetitio technica est temptare num quae sint phaenomena temere in processu experimentali, ut credibilia efficiat experimentalia, hoc est ad vitandum errores, in medium accipiendo, sicut saepe dicimus.

Negative Imperium-NTC et NRT
NTC (Non-Template Imperium)moderatio sine exemplo adhibetur ad comprobandum an materia experimentalis contaminata sit.Fere aqua adhibetur ut exemplum.Si reactionem fluorescens est, indicat contaminationem acidum nucleicum accidisse in laboratorio.

Hae inquinationes ex: aqua impura, regentes inhabiles, in quibus endogenous DNA, prima pollutio, instrumentorum laboratorium pollutio, inquinatio aerosol, etc., opus est uti RNase scavengers et RNase inhibitores.Aerosol pollutio difficillima est ad inveniendum.Finge laboratorium tuum sicut smog, cum variis acida nucleica in aere suspensa.

NRT (Non-Reverse Transscriptase), imperium sine transpositione transpositione non-reverse transcribitur RNA sicut imperium negativum, quod est imperium gDNA residuum.

Cum gene expressionem faciens, moles RNA deprehendendo quantitatem cDNA post transcriptionem transversam deprehendit.Si residuum sit gDNA purgato RNA, errores in eventibus experimentalibus causabit, quia eventus consecuti sunt gDNA et cDNA.In gradu aggregati, non tantum cDNA, gDNA per RNA extractionem penitus removeri debet.

MIQE (2) -sample informationes
Sic dicta specimen informationum significat quod cum articulum de qPCR evulgamus, debemus clare exponere informationes sample, quae pars articuli necessaria est.Similiter, cum exemplaria processus, etiam proprias operationes moderari debemus ad exemplorum validitatem curare.

Speciminis descriptio tantum effectus est, et in toto experimento materias sumptas magis attendere debemus.

Electio materiae experimentalis
Sanguis exempla - sumo sanguinem recens, non plus quam IV horas.Exempla cella - elige novas cellulas in periodo vegetationis incrementi colligere.Animal TEXTUS—Elige nova, TEXTUS strenue crescens.Planta TEXTUS – Elige recens, iuvenum textus.

Animadvertendum est verbum praecipuum esse in his paucis sententiis: nova.
Ad exempla superiora, optimum, sumptus efficens, et firmum ornamentum in foro est ornamentum Foregenorum, quod cito et facile DNA et RNA extrahere possunt.

Sanguis DNA Mini Kit

Cell Total RNA Isolation Kit

Animal Total RNA Isolation Kit

Plant Total RNA Isolation Kit

Plant Total RNA Isolation Kit Plus

Plant DNA Isolation Kit

Repono experimentalis materiae
Generaliter exempla thesaurizare non commendamus, si condiciones permittunt.Sed multi sunt amici qui experimenta statim post sampling gerere non possunt, quidam etiam lacus NITROGENIUM liquidum ad campum sampling portare necesse est.

Hoc enim genus laborantis amice, tantum possum dicere quod consumables iodi non intelligis.Nunc plures societates reagentes consumabiles regentes efficiunt quae RNA exemplaria ad cella temperiei reponunt, et his uti potes.Modus repositionis conventionalis est liquida repositionis nitrogenii, utens parva piscina liquida NITROGENIUM quae facile est ad portandum.Exemplar reducto ad officinam redacto, -80°C in armario repone.

Experimenta ad RNA, principium sex verbi sequendum est:frigiditas , no enzymes ,etceler .

Conceptus frigiditatis facile est intelligere;sine enzymes, RNase ubique in mundo vivimus (aliter caesus esses ab HIV), quomodo vitare RNase, cum experimenta faciebant, notio gravissima est;celer,Nulla Kung Fu in mundo est quae frangi non potest, celeritas sola frangi non potest.

Ergo quodammodo, quo breviore tempore extractio, melior ornamentum est.Cur?Foregeneōrnāmenta ōrnāmenta celeritāte egent, quod bene norunt.

PS: Quaedam puellae experimenta diligentissime faciunt, sed non tam bona sunt quam slam cursus post aliquot annos laboris.Deum esse iniquum sentiunt, de aliis queruntur, et vitam quaerunt.Non enim intellexit.RNA bene tutatus non est, et scaenicus cursus cursus auctor erat.Cum experimentum ageret, putabat se ter et quinquies et bifariam persecutum esse consummaturum, sed bene experimentum fecit.

Nota: tardius, casus rnas invasionis.Quomodo te exerce ad ieiunium?Non est, modo plus exerceas.

Pro diversis experimentis et diversis exemplis, necesse est adhuc plura legere litteras et aptam methodum processus eligere.Ad collectionem sample et processum repositionis, MIQE postulat ut in charta clare scriptum sit, ut recognitores fidem chartae recensere possint, et iuvenibus sopitis quoque convenit experimentum tuum repetere.

Etsi experimenta biologica difficilia sunt, summus finis tamen est.Si non caves, mundum evertere potes.Exempli gratia, SARS in discrimen diam facere, vel oryza hybrida facere ad 1.3 miliarda hominum salvandos.Pictura infra experimentum chemicum est, debes intelligere quam superbus sis in investigationibus tuis solum per aspectum dick-similem speciem.Oblivisci, noli illum denigrare.

MIQE (3) — extractio acidi nuclei.
Extractio acidi nuclei magnus eventus est, et omnia experimenta biologiae hypotheticae ab acido nuclei extractione incipiunt.Primum exemplum MIQE contentum de acido nucleico extrahendo.

Hanc formam spectans, in superficie manere non potes.Forma dogma est.Summum studiosum esse, quaerendum est quare.Essentiale huius tabulae est: Persequerepuritas, integritas, constantia, et extractio copia RNA .

Prima parsprocessus seu instrumentum est gradus extractionis acidi nuclei.Si vis latae nuclei acidorum nuclei extractoris uteris ad extrahendum (provectus, pete me ad emptionem), exemplar nomen instrumenti indicare debes.

Nomen ornamentum et

quid ornamentum adhibitum ad singulas commutationes, quaeve speciales procuratores adiciantur aut quaenam operationes speciales factae sint, dilucide explicandum est, ut alii experimentum tuum facile repetant.

Nonnulli regentes speciales addunt aliqua specimina specialia cum extrahendis, putantes hoc esse telum secretum suum et aliis non dicere.Dum illud secretum servant, etiam occasionem ut tuum articulum luceat.Noli esse ingeniosus, te honestiorem esse quam villam veterem Zhang in investigationibus scientificis, si callidus esse vis, stultum te articulum faciet.

oportet meminisse productum numerum ornamentumcum ornamentum et articulum scribere iubes .Fere duo sunt numeri in ornamentum: Cat-catalog numerus (numerus productorum, numerus articulus), Lot-productum multus numerus (Ad designandum quo batch producto e venit).

Praeterea numerus CAS saepe adhibetur cum regentes diam ordinando et simul populare faciam.Numerus CAS est numerus a Societate Chemical Americanus unicuique novo medicamento chemico.Fere tres numeri uirgula connectuntur.CAS Rushui's numerus: 7732-18-5.Chemical plures aliases saepe habent, sed numerus CAS singularis est.Cum medicinam iubes, primum numerum eius CAS inspicere potes.

Propius domum, quid habemus haec clare describere?Quin etiam extraction qualitatem RNA reprimendam est.Usus instrumentorum et ornamentorum RNA extraction constantiorem faciet.Extractio scalarum ordinariarum laboratorium non magna est, et cum kits obtineri potest.

Singula DNase vel RNase curatio
Gravis exitus quantitatis PCR fluorescentis est, ne DNA contagione sit, nec experimentum, si contagione est.Ideo necesse est ut processum, quem DNA processurus es, exponas, ut DNA in processu experimentali penitus et omnino remotum esse demonstret.per schematic tabula.

Schematica schematismi RNA et DNA
In genere, methodus DNA tollendi RNA cum DNase extractione tractaturus est.Sed hi sunt inter se veteres.Commercial RNA extraction kits DNA in processu extractionis sine addito DNase removere potuerunt.Exempli gratia, series rhoncus posuere a Foregen.

Nota: DNA in RNA extractio removere valde periculosum est gladius anceps, qui operationem extrahendi tempus RNA trahet et periculum degradationis RNA augebit.Plerumque, commercium est inter RNA cede ac puritatem.

Praeterea copia DNase additae adsorptionis columnae silicae valde parvae est, et qualis DNase ad effectum consequendum adhibenda est.Unoptimized DNase cito et perfecte concoqui non potest.Haec probatio technicae artis mercatoris est.Nimirum etiam sunt mercatores fatui qui iactant DNA sine DNase tolli posse.Dici potest, quisquis gloriatur DNA sine DNase tolli posse, scelestum esse.DNA structura duplice subductis relative stabilis est, et solum loquendo et ridendo deleri non potest.

Contaminationem taxationem
taxatio methodi: deprehensio electrophoresis, 1% agarosa, 6V/cm, 15min, onerata 1-3 ul.

Acidum nuclei quantitatis analysis
uti UV spectrophotometer metiri solet.Fac me primum popularem significationem trium bonorum OD260, OD280, OD230.
·OD260nm: Effusio necem summae effusio cacuminis acidi nucleici et optimae mensurae valoris iugis ab 0.1 ad 1.0.Sin minus, extenuant vel intendant specimen ut illud in ictum producant.
·OD280nm: Effusio necem summae effusio cacumen interdum et phenolicarum substantiarum.
· OD230nm: effusio necem altissimi carbohydratorum effusio.

Deinceps de munere cuiusque indicatoris fama est.Pro A260, adhiberi potest ut fruges acidi nucleici metirentur.Cum OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Ad puritatem, inspicere debemus rationes quas vulgo videmus: OD260/280 et OD260/230.
·pura DNA: OD260/280 proxime acqualis est 1.8.Cum maior quam 1.9 est, indicat pollutio RNA, quae cum minor 1.6 est, interdum et phenol inquinationem esse indicat.
Purus RNA: 1.7
·OD260/230: Utrum DNA vel RNA sit, valor relatio est 2.5.Cum minus quam 2.0 est, indicat pollutio sacchari, salis et organici materiam esse.

RNA integritas

RNA integritas magni momenti est metiri.Fere, RNA denaturationis gel experimentum facere necesse est ut inspicias num claritas inter 28S et 18S RNA sit duplex relatio.Ubi tertia cohors 5S apparet, significat RNA degradare coepisse, exceptis invertebratis.

Data pro RNA taxatio qualitatis: Praeter supra probata, sunt etiam quaedam instrumenta probatoria provectioris secundum integritatem RNA, sicut RQI integritas experimenti systematis electronici experimenti automatici, quod deprehendere potest utrum RNA invisibiliter degradetur.

In investigationibus scientificis, quantitatis PCR fluorescentis comparatio est inter gene scopum et gene referentia internum.Itaque in processu RNA sample conservationis, RNA extractionis, etc., finis primus integritatem RNA curet.

Quomodo integritas RNA trutinam afficit inter gene scopo et gene referentia interna, ex figura infra facile intelligi potest.Degradatio ad gene incompletionem ducet, sive sit imperfectio internae relationis gene an incompletio scopo gene, magnum momentum in notitia habebit.

Schematic schematismus de scopo gene et gene referente, necesse est non esse verum

Test inhibitionis (sive CT valor supprimatur sub concentratione alto vel minore vel aliis conditionibus)

Hac figura in exemplum posita, valores quinque curvarum Ct sunt hae.Distributio valorum CT inter curvas inaequabilis est, et CT bona sub concentratione alto et infimo morantur, quod accidit in inhibitionis PCR.

Clavis punctum: In processu RNA extractionis, necesse est fallacias relinquere et rectas constituere.

Falsa opinio est: RNA extractionem tantum cede persequitur, putans RNA maiorem quantitatem consecutam, meliorem.Nam cum quantitas agimus, si numerus generum non est magnus numerus, non multum RNA opus est.RNA moles elicis superque est .

Recta notio est:RNA puritas, integritas et constantia sequantur.Puritas efficere potest ut transcriptio sequens adversa non obstat nec notitia DNA affici non possit.Integritas efficit proportionem scopo sequentiarum et internarum indiciorum.Constantia stabilis specimen loading praestat.

MIQE (4) – reverse transcription
Deceptae: studio majoris exempli voluminis.
Recte conceptum: Constanciam (stabilitatem sequere), quantumcumque RNA onerata moles, efficientia transpositionis transpositionis constantem manet, ut differentias in cDNA revera differentias in variantibus reflectere possit.
Explicamus hunc processum cum schemate schematico:

Schematica schematis de transpositione transpositionis efficientiae, noli esse vera
Imprimis intelligendum est differentiam inter processum transpositionis et per processum transpositionis.PCR multiplices calefactiones et furnum processuum patitur, et scopum fragmentum exponentialiter crescit;dum transpositio transversa hunc processum non habet, existimare possumus transpositionem transpositionem esse actu unum ad unum Per processum replicationis, totidem partes RNA.

quot fragmenta cDNA Informatio fieri potest, nunc intelligendum est, quia fragmenta magna et parva transscripta sunt, et in uno fragmento intendere non potest.Et quia quantitas RNA relative parva est, moles cDNA consecuta est etiam relative parva, PCR dissimilis, quae amplificationis effectum habet, ideo basically impossibile est deprehendere.

cDNA electrophoresis eventus
Secundo, optime, transpositio transpositione facta est ad unum, sed nulla transpositio transcriptase ab aliquo comitatu ad hunc effectum assequi potest.Plerumque, efficientia transumptorum maxime transversarum inter 30-50% vagatur.Quod si ita est, transpositionem stabilitatem relative stabilitatem habere volumus, quae in figura videre volumus: 3 RNAs posside 2 cDNAs, 6 RNAs 4 cDNAs posside, ergo quantumcumque oneratur specimen, altera transcriptio efficientia relative stabilis est.Nolumus videre condicionem ubi transumptionis evolutionis efficientia instabilis est et alta intentio ligatur.

Quomodo igitur verificatur an efficientia e contrario transcriptionis stabilis sit?Modus valde simplex est, tantum opus est ut testam comparationis facias: unum est transscribere in cDNA post duplicem dilutionem RNA, et alterum est duplicare dilutionem post transcribendum in cDNA, et deinde fac qPCR videre praeceptionem nactus num stat.Ut in summo discipulo, debes in secundis intelligere.Ut infra patebit:

Dilutio RNA et cDNA ad probandum an efficacia transcriptionis e contrario stabilis sit
Reverse transcriptase et ornamentum
Quomodo perfectam quantitatem fluorescent pcr optimam transpositionem transcriptase et ornamentum habeat.Reverse transcriptase fere in duas species dividitur secundum fontem, AMV or .M-MLVet ludicris idem est quod in tabula.

RNAse II actio
RNase H est Ribonuclease H, nomen Sinensis est ribonuclease H, quod est endoribonuclease quae proprie hydrolyzare RNA in catena hybrida DNA-RNA potest.RNase H vincula phosphodiestri in singulis subductis vel subductis DNA vel RNA, non potest concoquere, id est DNA vel RNA vel subductis.Communiter in synthesi secundae cDNA.

Res mira est.Dicimus transpositionem transcriptase habere RNase H activitatem, non quod transcriptase RNase H continet, et RNase H separare non potest ab transverso transcriptase, fortasse propter conformationem quorundam coetuum transposito transcriptase Haec actio causatur ex transverso transcriptase.

Itaque, ratione superiore transversalis transcriptionis efficientiam ipsius AMV, actio eius RNase H redigit cedere cDNA.Scilicet, artifices reagentes constanter suos fructus optimizing eliminare RNase H activitatem e transverso transcriptase quam maxime cessus cDNA augere possunt.
Anneaning temperatus

Secundarium structura RNA in diversis temperaturis
Figuram supra vide ad structuram secundariam RNA in diversis temperaturis, et mFold online instrumento utere ut structuram secundariam scopo fragmenti sub certis conditionibus caliditatis et salis concentrationis definias.Ad 55°C, structura secundaria RNA adhuc valde implicata est, e contrario transcriptase laborare non potest, et secunda structura perfecte resolvi non potest nisi 65°C, optima temperie AMV et M-MLV longe inferior quam haec temperatura.
Quid facere?Secundaria structura est complementarium coniugationis ipsius Formulae, quae ducit ad contentionem fortis inter transcriptase et primarium et exemplum, consequens in problematum serie, ut humilis E et inopes repeatability.

Quid facere?Tantum auge temperatura furnum quam maxime.

Multi artifices regentes transpositionem transpositam per machinationem geneticam emendantes sunt.Temperantiae reactionem augent quidam, ut Jifan et Aidelai, et quidam activum RNase H enzyme removent ad affinitatem inter enzyme et RNA templates meliores.Alta affinitas certatim exprimi potest structuram secundariam et perlegere perlegere, ac etiam efficaciam transmissionis transcriptionis valde emendare.
Clavis punctus: Reverse transcriptio potior est ad consectandum constantiam transversalis efficientiae (enzymes non solum esse efficientem sed etiam stabilem), quam moles exempli onustae, si non sit magna-scala fluorescentis quantitatis PCR peculiariter, omnino possibile non erit.Multae cDNAs.
Varii etiam artifices in studio constantiae aliquos labores fecerunt.Exempli gratia, pleraeque societates nunc transpositione involucro implicatae sunt ut vexillum ornamentum pro venditionis, quod est bonum electionis.
Exempli gratia, Foregene's RT Securus Series kits:

RT Securus I (Magister premix pro prima linea cDNA synthesis ornamentum)

MIQE (5) - target gene informationes

Figura supra explicata
1. Utrum hoc genus efficax sit ad iteratis experimentis generaliter per iteratis experimentis verificari potest.
2. GENE ID, Scis.
Gene longitudo, tota longitudo scopo gene est certus dubium.Cum primers cogitans, longitudo amplicon inter 80-200bp est, ut efficientiam amplificationis meliorem efficiat.
4. Sequentia Blast informationes comparationis, scopus gene in genebank comparati debet ad amplificationem non specificam praecavendam.
5. Praesentia Pseudogenis.Pseudogene series DNA est gene normali similis, sed functionem normalem amittit.Saepe in multi- gene familia eukaryotarum exstat.Solet per ψ.Est exemplum genomicum DNA non-muneris in genome quod est seriei gene coding simillimum.fere non transcribitur, nec dud.
6. Positio primarum relativa ad exons et introns.Primis annis, cum problema contaminationis DNA solvimus, saepe posiciones primariorum, exonum et intronorum attendimus, et plerumque primarios trans intronas ad vitandam amplificationem DNA excogitantes spectavimus.Figuram infra videbis: nigrae intronas, variae caeruleae exonae significant, rosea primarios communes, rubra primarii intro-plana significat.

Schematica, numquam vera
Quae perfecta ratio hoc videtur, sed re vera, in pluribus, primarii trans-intronivi non tam magici quam imaginati sunt, et amplificationem etiam non specialem facient.Optime igitur ne DNA contaminationem DNA totaliter removeat.
7. Conformatio vaticinii.Hoc exemplo iterum utens, mFold online instrumento utere ut structuram secundariam scopumi fragmenti determinet in quadam condicione caliditatis et salis concentratio.

Secundarium structura RNA in diversis temperaturis
Secundaria structura est complementaria coniugationis ipsius Formulae, quae ad validum certamen inter primarium et templates connubium ducet, et casus primi vinciendi minus sunt, unde in problematum serie, sicut E humili et inopes repetabilitas.Per programmatum praedictionem, si nulla quaestio secundae structurae est, id magnae fore.Quod si est, in specie de quonam modo hanc problema solvendum sit, noster sequens articulus discutiet.

MIQE (6) -qPCR Oligonucleotides

Fluorescent quantitatis PER. Primum quod luctaris cum omni die est RNA extractio, et res secunda potest esse prima intentio.
Primum omnium, adhuc regulas de primario consilio secundum MIQE circumscriptum reprehendo.Tam simplex est ut scumbags ridere possit, et in una sententia perficere possumus: sequentia et positio primi explorandi et modificationis methodum exquire.Ad primam methodum purificationis, prima synthesis tam vilis est in praesenti, qPCR PAGE et supra methodis purificationis digna est, ac notitia synthesis instrumenti non magni momenti est.Multi homines primarios per decades faciebant et synthesizer ABI3900 esse nesciunt.
Quoad principia primarii designationis, ea per rotulam meminisse non debes, quia primarium consilium programmatum vel instrumenta online cura harum problematum curare possunt (commendatur instrumenti primarii primer3.ut.ee/), et 99.999% primi consilii non est manually Ecce auctor interdum centum primariorum diem designat, si singillatim legas, fiet luscus.
Iustus reprehendo puncta sequentia post primers designantur:
1. Dedo primariis prope 3′ finem: In casu utendi oligo dT primers pro cDNA synthesin primitiva, considerans transpositionem efficientiam et integritatem RNA, primarii designati necesse est designari prope 3′ finem ad amplificationem augendi efficientiam.Pictura utere ut sic explices (hoc nullo modo intelligendum est);

Cur primores designentur prope finem 3′, verum non est
2. TM valorem: Tm valor ad 55-65°C (quia actio exonucleasis altissima est ad 60°C), et GC contentum ad 40%-60% est.
3. Blastus: Ad vitandam genome amplificationem non specialem, inspiratione ad supplementum verificationis adhibenda est.

MIQE(7)-qPCR process

1. qPCR ornamentum
Secundum requisita MIQE, plane describere debemus integram reactionem condiciones in articulo, incluso configurationis PCR reactionis systematis, quod ornamentum adhibetur, quis fabricator, quantus sit reactionis ratio, sive tinctura methodi sive explorationis modus adhibeatur, PCR programma occasus.Coegi veterani certum invenient, dum ornamentum delectatur, informationes praedictas fundamentaliter determinatas esse.
Nunc, fabrica et productio quantitatis fluorescentis PCR kits valde matura est.Quamdiu malos artifices non eligis, probabilitas quaestionum alta non est, sed adhuc pauca tecum communicare volumus:
Hot-satus Taq enzyme:Maxima pars PCR est calidus-initium Taq enzyme.Calidum enzyme in foro plerumque in duo genera dividitur, unum est enzyme calidum-initium chemica modificatum (potes paraffin embedding), alterum est enzymum calidum pro modificatione antigeni-anticorporis (obligatio anticorporis).Modificatio chemica prima est modus enzymes calidi-incipiendi.Cum temperatura certa pervenerit, enzyme actionem suam liberabit.Antibody-modicatum enzyme calidum-initium utitur modis biologicis ad arcendam enzyme actionem.Cum temperatura certa pervenerit, anticorpus denaturabitur et inextinguibitur ut interdum, et actio enzyme in fabula agetur.

Sed quid opus est hoc?Ita est, emissio actio enzymorum anticorporum mutatorum celerior est quam enzymorum chemicorum modificatorum, et secundum sensus sensitivum, anticorporum enzymorum modice commodum habent, ita ut enzymes chemicae modificatae plerumque non sint in kits mercato.Si nulla est, haec technicae artis fabrica adhuc in millennio adhaesit.
Magnesium ion retrahitur ;Magnesium concentratio ion magni momenti est in pcr motum.Apta magnesii intentio promovere potest remissionem Taq enzyme activitatem.Si intentio est preme, actio enzyme signanter minuetur;si intentio nimis alta est, amplificatio enzyme-catalyzed non specificae augebitur.Magnesium coniunctio etiam afficit annales primorum, tabescentium Formulae et PCR productorum liquefaciens, eo quod cedat fragmentorum amplificatorum afficiens.Magnesium retrahitur fere ad 25mM regitur.Utique, ad ornamentum bonum, magnesii intentiones bene regi debent.Nonnulli mercatores magnesium ion chelante agenti regenti addunt, quod effectum temperatio activitatis magnetis ion concentratio consequi potest.
Tinctura fluorescentium defectus;Tinctura fluorescens, quae est SYBR Viridis uti solemus, maxime fluorescentiam generat, ligando ad DNA duplicatam sulcam minorem, quia ligatio tinctura DNA subductis non specifica est, hoc est, quamdiu DNA duplex subductis cum eo componitur, fluxus fieri potest, ideo primario-dimers et DNA formare signum in DNA formare potest.
PS: Ob leves sensitivas proprietates, producta in foro plerumque in tubulis centrifugis opacis fuscis fasciculatis (ut in tabula infra ostendetur).Sed id perspiciatis consequat.Difficile est videre num liquorem ebibitur cum sampling.Qua in re, Qingke quidem maxime user-amicus est (ut infra in tabula exhibetur), et tubus pellucidus in sacculo opaco stagno sarcinatus est.Deinde in sacculum stannum imposuit, ratione habita commoditatis lucis et sampling vitandi.Productum numerum ius eligere debes.TSE204 eximius efficax exsistentia est, quae me gramen plantare velle facit.

Gravissima etiam retrahitur tinctura fluorescentium.Si intentio est humilis, amplificatio curva non ascendet in ulteriorem scenam nec perfecta est;si celsior coniunctio est, impedimentum strepitus causabit.Cum quantitatis PCR fluorescentis principaliter a valore CT pendeat, si concentratio tincturae fluorescentis proprie non adaequatur, punctum humile melius est quam fastigium.Scilicet optima est conveniens tinctura retrahitur.

ROX: ROX tinguntur ad bene ad bene fluorescentiae signum mendosum corrigendum.Instrumentum aliquod fabricantes calibrationem requirunt, alii autem non.Exempli causa, usus Thermo Piscatoris Scientificis Real Time PCR amplificationis instrumenti calibrationem plerumque requirit, incluso 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, etc. Commune ornamentum instructionum illud describet.
qPCR Foregene's Mix etiam continet ROX tinctura, quae in variis exemplaribus usui accommodata est.

Verus tempus PCR Kit-Taqman

Debilis hydrogenii vinculum curatio: Curatio vinculorum hydrogenii infirmorum est materia relative technica.Nihil manuales plurium ornamentorum perlegit, sed nemo ex iis hoc loco nominavit.Nam ut maximus est.Compositio basium a viribus vinculorum hydrogenii maxime pendet.Vincula consectetuer valida sunt amplificatio normalia, et vincula hydrogenii debiles ad ampliationem non specificam perducunt.Si vincula hydrogenii infirma bene exstingui non possunt, amplificatio non specifica vitari non potest.In ambitu auctoris, paucae tantum turmae hoc problema animadverterunt.Cum ornamentum emis, referre potes an solutionem cogitaveris hac de re ornamentum quod vis eligere.

Reactio volumen: The 20-50ul system is more commonly used, and smaller volumes are likely to cause errors.In universum ornamentum instructionum usum voluminum per reactionem commendabit.Noli sapere et minoribus voluminibus utere ad aliquas sumptus.metam.Volumen a mercatoribus commendatum reapse probatum est, et fortasse problema errorum parvorum voluminum causatorum solvere non possunt.
2. Fabricator et articulus numerus laminae tubi
Quisque scit principium quantitatis PCR fluorescentis.Fluorescentiae collectio maxime peragitur per galeros pcr tubum.Cum pcr consumables eligendo, duo puncta attende: bonam lucem tradendi et instrumenti aptam.Generaliter tabulae et fistulae notarum amet sunt bene, sed diligenter eligere debes secundum adaptationem, alioquin instrumento uti non poteris.

4. Top gradu scientia

MIQE (8) -qPCR sanatio
Hoc est summum prioritatem qPCR!Tot heroes hic in arena ceciderunt.Scilicet, etiam possibile est ut sis felix et simplex gena studuisti, sic per antrum glaciem per ventum denatasti.Verificationis notitia de qPCR intendit probare notitiarum fidem.De his quae necessaria sunt verificationis notitia ut sequitur:

1.Specificity test
Specificatio scopo gene amplificationis probatur annotando num imago electronicorisis sit una manus;sequentia verificationem;si tabula ad apicem unius curvae prostrata est;enzyme digestio verificationis et aliis modis.
Hic, t intendunthe analysis of non-specificae amplificationis utendi modum curvarum liquationis.Plerumque loquendo, cum primarios designamus, magnitudo fragmenti producti in amplitudine 80-200bp debet esse, quod liquatio caloris PCR producti 80-85 °C iugi efficit.Si igitur cacumina miscellaneae sunt, oportet esse alias productorum non specialium amplificationes;si apicem infra 80°C apparet, generaliter dimer censetur;si apicem supra 85°C apparet, generaliter DNA contaminationem vel amplificationem nonspecificam magnarum fragmentorum esse censetur.
Nota: Aliquando unum tantum apicem in 80°C.Hoc tempore, haec notio adhibenda est.Verisimile est omnes eventus amplificationis primores dimersos esse.

Normalis curvae liquefactionem (cum nullum non specialium amplificationis apicem unum)

Problematica curva liquatio (exaggeratio cacumina spuria non-specialis)
Case analysis】

Praecipuum cacumen est, sed primario dimer gravis est
Unius apicem curvae figurae infra liquescens facile oculos tuos fallere potest, putans esse experimentum perfectum, sed effectus est omnino erraticus.Hoc tempore spectare debemus ad temperatus liquefactio.Vertex temperatus infra 80°C est, quod est omnino primario-dimer.

Nullum scopum fragmentum omnia primario dimers
Hic non potest frater prohibere.Pictura infra est photographica photographica cum telephono mobili scumbag a me misso.Procuratores, quibus usus est, omnes usitato notarum industria.ex uno T-praepositionis notam in aliam T-praepositionem notam mutavit.Puto te iam coniectans.Scumbag ad me exclamavit: “Res gerens in prima tabula nimis bona est, et apicem simplex est.Postea, postquam te commendatum gerens usus est, fit sicut tabula secunda, cacumina mixta.miserum me fecisti."
Duas graphes separa.Alter primo aspectu unum cacumen habet, alterum duplicem apicem habet.Vnus cacumen ineptiarum est utique tenuis.Quod verum est?
Peior quam Dou E, si duas picturas infra in tabula posui, statim intelliges.In hoc enim genere picturae facile exanimati sumus.Post diligenti analysi invenimus: cacumen figurae primae esse in 75°C, quod est omnino primarium;secundae figurae apicem ad 75°C et 82°C apparet, saltem productum apparet.

Pictures of feedback ex alumni
Ita problema fundamentale reagentium non est quaestio, sed quaestio de primario consilio.Simul etiam probat quasdam magnas notas non ferreae qualitates, et etiam probat quod frater meus supra dixit: Non est notam gerens, quae articulum tuum sustinet.Articulus tuus est qui notam reagentium fulta est.Cogita modo, si regentes scumbag non mutaret, data iniuria ephemeride mitteretur, et quid eventurum esset tragoedia.
2. Ct valorem in blank imperium
Noli explicare, si imperium blank vim habet, annon polluit?Sed adhuc debes intelligere quam potestatem blank potestatem Ct valorem habet.Si NTC est, significat alienum DNA ut contagione iodi.Si NRT est, significat extractum RNA contaminationem DNA habere.
3. Latin curva
Complectens clivum et formulam calculi, PCR efficientiam per formulam computari potest.Perfectum experimentum requirit clivum curvae regulae ad 3.32 accedendi, et R² accedere ad 0.9999.
4. Linearibus dynamic range
Motus motus dynamicus est linearis.Secundum exemplar quod ad curvam vexillum generandum adhibitum est, dynamica range V saltem graduum concentratio comprehendere debet, et attendere ad mutationem ct valorum in gradibus concentrationis altae et graduum concentrationis humilis.
5. Deprehensio accurate
Mutationes in qPCR proventuum, id est, iterabilitas pauperum, id est, subtilitas pauperum, causantur a pluribus causis, incluso temperie, intentione, et operatione.qPCR subtilitas plerumque minus moderatior fit quam exemplum numerus decrescit.Optime intra experimentalem variationem, haec variatio technica a variatione biologica debet distingui, et replicationes biologicae possunt directe compellare differentias statisticas in qPCR proventuum inter coetus vel curationes.Speciatim pro diagnostica pertentat, optima inter-tentabilitas (repetibilitas) trans situs et operariorum nuntiari debet.
6. Deprehensio efficientiam et LOD (in multiplex qPCR)
LOD infima concentratio 95% exemplorum positivi deprehenditur.Aliis verbis, coniunctio LOD contenta in statuto scopi generum replicationum non excedere 5% de reactionibus deficientibus.Cum multiplex qPCR analysin faciens, praesertim ad detectionem punctorum mutationum vel polymorphismi, multiplex qPCR opus est ad probationes ponendas quod accuratio multiplex fragmentorum scoporum in eodem tubo non est suspectus, multiplex detectio et una tubus deprehensio Efficientia et LOD idem esse debent.Praesertim cum summus intentio- nis scopum genes et low-concentratio scopum generum simul ampliatur, hoc problema attendere debet.
Problemata et solutionesGeneraliter problemata saepe occurrunt in qPCR debugging focus in sequentibus aspectibus:
· amplificationem non specificae
· Difficilis electio primae intentionis et angustiae cum primario dimers
·Tempusculum furnum improprium est
· Secundae structurae amplificationem efficientiam afficit
specificae amplificationis
non specialium amplificationisoccurrit, generaliter consideratur an non conveniat primum consilium, sed si non properas mutare primarios, potes modos sequentes tentare primos (principium etiam adnexum);
·Crescite temperatura furnum – conantur ut vincula consectetuer debiles ponere non valentes sint;
·Abbrevia furnum et tempus elongationis – reducere casum consectetuer vinculorum infirmarum;
· Reduc primum intentionem - reducere occasionem ligandi primorum redundantium et regionum non-scoporum;
Maximum amplificationis efficientiam
Oppositae condiciones ad amplificationem non specialem - efficientiam amplificationis humilem, et mensurae ad efficientiam amplificationem tractandam humiliatae sunt contrariae:
·Prorogare tempus furnum et elongationem;
·Converte in tres gradus PCR et temperatura furnum minue;
· Auge primam intentionem;
PsMulti alumni alumni in 90s nati studere nolunt quomodo debug experimenta, et sperant ornamentum problema omnino solvere (si vis adire in comitatu ad investigationem et progressionem post graduationem remissibilem facere), re vera etiam identidem artifices hoc modo putant, ut spero, stultum est posse cum id accipias, tam reagens artifices multum laboris ad solvendam quaestionem amplificationum non-sponsorum includunt.Ad quaestionem facile solvendam, stultorum adhuc societas reaentis legere debet introductio ad videndum si elementum est quod vincula hydrogenii infirma concipit.
Difficile optio primae intentionis et tribulationis cum primario-dimers
Modus 1: Generaliter ornamentum instructionum qPCR rationum commendaverunt ac primos concentrationes commendaverunt.
Methodus 2: Debugging ab occasu primitivam intentionem clivi.Pictura infra surrepta e coetu illustrata.Figura infra ostendit proventus quantitatis fluorescentiae factae cum tribus primis gradientibus concentratione (100nM, 250nM, 500nM) et quattuor gradibus concentrationis (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).Valor Ct eventus experimentalis insidiatus est hoc modo:

Prima Concentratio Electio Concatenata unaquaeque concentratio primario in lineam hoc modo:

Electio primae intentionis manifesta est, melior est relatio linearis primae intentionis 100nM et 250nM, et relatio linearis primae intentionis 500nM est relative pauper.In 100nM et 250nM, valor 250nM CT est relative parva, ergo optimalis intentio prima 250nM est.Plerumque gravia primario-dimers in liquefactione curva videri potest.Quid si primarios designati primarios dimersos vitare non possunt?
Modus 3: Quantum primariorum reducere et temperatura furnum augere (nihil opus est explicare).
Empiricus valor temperatus furnarii est LX°C.Si non es certus, quomodo deligere commodiorem furnum temperiem?Respondetur idem quod intentio primae electionis -CLIVUS test.Accipe imaginem a comitatu Bio-Rad ad problema illustrandum.Ad amplificationem cuiusdam scopi fragmenti, octo graduum temperaturarum, singulis tribus repetitionibus, et amplificationis curvae consecutus est hoc modo:

furnum temperatura delectu :
70°C, 69°C- Basice primarii coniungi non possunt; amplificatio ergo non est.
·67.3°C - Exigua est ampliationis in initio, et Ct valor relative magnus.
·64.5°C — Ct valor decrescit.
·Ad 60.7°C, 58.0°C, 56.2°C, et 55.0°C, valores Ct stabilia fundamentaliter tendebant, sed valores finales fluorescentes diversi erant.
Quomodo eligere?Principium: Primum principium est altior Ct valor.Ad idem Ct valorem, superiorem furnum temperatus elige ad vitandam dimerizationem et amplificationem non specialem.Quamvis altior valoris fluorescens 55°C sit, in eo tamen amplificatio dimers vel non-specialis existit.
Sed si tam sapis quam tu, plane cogitas: Logice loquendo, si PC reactionem valde specificam est, dum primarius intentio minimam exigentiam excedit, puncta alta et infima nullum effectum habere debent, sicut tingui fluorescentes et dNTPs.Quamdiu enim in furnum temperatura proprie optimized est, effectus primae intentionis in Ct valore naturaliter elevat.

Temperatus furnum proprie optimized est, et effectus primae intentionis in CT minuetur
Secundae structurae amplificationem afficit efficientiam
Imaginem sumamus ex Bio-rad ad problema illustrandum.Etiam clivum temperatum designat ad ampliandum gena cum structura secundaria.

Secundarium structuram emergit
Videri potest quod, cum clivus temperatus decrescat, producta apparere incipiunt et valorem Ct promovet, valorem minimum attingens ad 60.7°C, et tunc, cum clivus temperatus decrescat, Ct valorem fit maius.Vice versa, temperaturas auget, structura secundaria aperit et amplificatio efficientiae auget.Post quandam temperiem attingens, temperatura augens augere efficientiam augere non potest.Quia primarii hoc tempore stabiliter coniungi non possunt.Ergo,expecto temperatus cum imo ct valoremquae est optima temperies ad amplificandas secundas structuras templates!Sane callidi stultorum oportet scire, quod si non est necessarium, melius est primarium mutare et secundae structurae regionem vitare.
5. Application gradu
MIQE-Data Analysis

Analysis notationis maxime datur a quantitatis fluorescentibus PCR instrumenti.In superiori articulo, multum analyseos opus factum est, ut blank temperantia, quae in ratione experimenti explicata est.Interna relatio genes, numeri repetere, etc. declarati sunt.maxime applica- tionem qPCR hic explicamus.
qPCR late adhibetur, et verificationis experimentalis ac diagnosis acidi nuclei in missionibus frequentissimis adhibentur.
absoluta quantitas
Log (contentio initialis) linearem necessitudinem cum numero cyclorum habet.Vexillum curvae trahi potest ex signo cum numero noto exemplarium initiali, hoc est, relationem linearis amplificationis reactionis obtineri potest.Secundum CT valorem exempli, intentio in sample calculi potest.Moles templates includere.

Absoluta quantitatis Calculus Methodus
Quantitas absoluta in linea curva ponenda est.Ut signum curvae fiat, vexillum requiritur.Usitas, vexillum plasmidum ex scopo gene exquisitis consecutum est.Quid est plasmidus?Quia plasmida DNA circularis firmissimum est.Vexillum producti in 5 ad 6 graduum secundum rationem duplicatam dilue (dilutionem 10 triplicem), et attende ad uniformitatem cum diluto.Sit Ct valor inter 15-30.

Praeparatio Standard
Eodem tempore, specimen probationis diluendum (memini factoris), et Ct valor etiam inter 15-30 cadere debet.Vexillum productum + specimen probandi in machina simul ponuntur.Post currendum, signum curvae cum substantia mensurae facta est, et exempla ut probanda deducebantur in curvam vexillum ad intentionem computandam.
Hepatitis B virus HBV quantitas est quantitas typica absoluta, quae virus exemplar numerum in 1ml sanguinis computare potest.
Calculus exemplum numerus
Sample intentio exploranda (ng/ul) = OD260 50ug/ml dilution factor
Sample pondus hypotheticum = numerus basium 324
Exemplar exemplum numeri explorandi (copia/ul) = retrahitur specimen probandum / pondus hypotheticum specimen × 6 × 1014

Calculus modus exemplaris numerus

Supradicta est ratio quantitatis calculi determinandi.Hoc problema mathematicum est, quod post gradibus junioribus alta schola solvi potest, et problemata mathematica vulgo a computatoribus solventur.Si non intelligis, communicare potes.
relativa quantitas
Quantitas relativa maxime in investigationibus scientificis adhibetur.Quot virus in sanguine 1ml sunt et est virus DNA, hoc eventum relativum deterministicum est: moles sanguinis determinari potest, et virus DNA relative stabilis est.Sed difficile est nobis numerum transcriptionum comparare exemplaribus cuiusdam gene in folio, quia difficile est ad magnitudinem, pondus et teneritudinem folii, quantitatem extracti RNA difficile determinare, et efficacia transversalis transcriptionis etiam difficile est determinare, hoc est, quivis gradus notitias experimentales habere cimices et adhiberi non potest.
Ergo quantitas relativa debet inducere elementum;internum referat gene.
Aliis verbis, quantitas relativa actualiter comparatio inter scopo gene et gene referentia internum.Comparari in eodem textu et in eadem cellula, influentia magnitudine exempli, RNA extractio quantitatis, transpositio transpositionis efficientiae, et PCR efficientia relative parva.Propter exiguum magnitudine exempli, gena et clypei interne referentes sunt relative reducti.Inde est quod uniformitatem et stabilitatem nobis anteponimus.
Internus referat genes sunt ferecustodiens genes(genesis domestici custodiendi), quod referunt ad genus generum in omnibus cellis stabiliter expressum, eorumque fructus necessarii sunt ad actiones cellularum vitae fundamentales conservandas.
Noli conceptum confundere.genes domestici termini functionis biologici sunt, cum gena referentia interna vocabula technica experimentalia sunt.genesis domestici sanationem facere oportet antequam seligi possint ut genes interna referentia.
Exempli gratia, plura genera custoditivarum in figura infra delegimus ad probandas expressiones earum in diversis cellulis textorum, et invenimus expressionem gradus β-2-microglobulinum longe diversum esse ab reliquorum trium generum, ita uti interna relatio generum esse non possent.

Postquam intellectus correctionis functionis internae referentiae gene, duo algorithmi derivantur ob introductionem gene prooemii interni.
· duplex modus curvae vexillum
· II - modum (ct modum comparationis valorem)
Si interest in studiis speciebus et functionibus gene, dare investigationem de algorithmis et formulas directe utere, vel machinis directe utere;Si recta vis in mathematicis et machinalis es, placet sentire liberum.
duplex modus curva vexillum
Quantitare scopum gene et gene custodiae imperii specimen et specimen probandum per curvam regulam, et deinde valorem relativum secundum formulam calculi, quae est expressio relativa.
Commoda: analysis simplex, optimization experimentalis relative simplex
Incommodum: Utraque gene, quaelibet experimentorum rotunditas debet facere regulam curvam
Applicatio: Una ex duobus modis quantitatis relativis communiter adhibitis et agnitis in studio regulae expressionis gene
Formula haec est:

Exempla sunt haec:

Computare quantitatem relativam fundatur in effectu quantitatis
II - Ct modum (ct modum comparationis valorem)

Utilitas: Non opus est facere vexillum curva
Incommoda: Ponitur amplificatio efficientiae prope C%;vexillum declinationis est <5%, et vexillum curvae et efficientia inter utramque amplificationem positam esse consentaneum est;Optimization condiciones experimentales magis implicatae sunt.
Applicatio: Una ex duobus modis quantitatis relativis communiter adhibitis et agnitis in studio regulae expressionis gene

Scilicet, amplificatio efficientiae plerumque impossibile est esse perfecte 1. Correctio methodi: Si scimus scopum gene et relatio gene habere eandem amplificationem efficientiam, amplificatio autem efficientiae non est aequalis 1 , tum 2－△△Ct corrigi potest ut: (1+E)－△△Ct, exempli gratia, si amplificatio efficientiae 0.95 est, calculi formula emendari potest ad 1.95－△△Ct.
Hucusque contentum de quantitatis fluorescentibus PCR ad finem pervenit.